Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu

3.5.1. Thu thập số liệu

- Đếm số mẫu sống, mẫu nhiễm, mẫu chết.

- Đếm số chồi: Đếm tổng số chồi và nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu. - Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.

28

3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi

- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu

+ Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:

Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) + Tỷ lệ mẫu sống nhiễm:

Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

+ Tỷ lệ mẫu chết:

Tổng số mẫu chết (mẫu)

Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

-Chỉ tiêu theo dõi chồi:

Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu)

Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

Tổng chồi thu được

Hệ số nhân chồi (lần) = × 100% Tổng chồi nuôi cấy

Hình thái chồi:

+ Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh

+ Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt + Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng

-Chỉ tiêu theo dõi ra rễ:

Tổng số chồi ra rễ (chồi)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100% Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)

29 + Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn. + Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ.

3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu

Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0.

30

Phần 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian của chất khử trùng H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng

Tái sinh mẫu cấy là bước đầu tiên rất quan trọng trong nuôi cấy in vitro. Đây là

giai đoạn tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho các quá trình nhân giống tiếp theo. Nếu

như bước tái sinh mẫu không thành công thì quy trình nhân giống in vitro cũng không

thể tiến hành. Để tiến hành tái sinh mẫu trước hết cần phải tiến hành khử trùng mẫu cho phù hợp với từng loại đối tượng cũng như từng loại mẫu khác nhau. Nguồn mẫu

cây Hài Hương Lan đưa vào nuôi cấy trong các thí nghiệm được lấy từ chồi và đỉnh

sinh trưởng thu thập ngoài tự nhiên nên chứa rất nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy, cần lựa chọn nồng độ, thời gian chất khử trùng thích hợp để loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.

Trong quá trình vô trùng mẫu để tiêu diệt nấm và vi khuẩn trên mẫu nuôi cấy, các nhà nghiên cứu thường sử dụng các chất hoá học có hoạt tính tiêu diệt nấm và vi khuẩn. Một số chất thường được sử dụng để khử trùng mẫu nuôi cấy như: Oxi

già hydroxid (H2O2), Calcium hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2),…

H2O2 là một trong các hoá chất có khả năng tiêu diệt nấm và vì khuẩn, không gây

ảnh hưởng lớn đến môi trường như thủy ngân, vì vậy nên những năm gần đây các thí nghiệm về nuôi cấy mô đã dần thay thế các chất như thủy ngân clorua bằng oxi già để giảm ô nhiễm môi trường .Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn H2O2 là chất khử trùng để tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng trong nghiên cứu của mình.

Để lựa chọn nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp cho cây Hài Hương Lan

(Paphiopedilum emersonii) chúng tôi đã thử nghiệm khả năng khử trùng với dung

dịch H2O2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau. Sau 7 ngày nuôi cấy kết quả thu

31

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H2O2 đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy)

Công thức Nồng độ (%) Thời gian (phút) Số mẫu đưa vào (mẫu)

Chỉ tiêu đánh giá Tỷ lệ mẫu

sống không nhiễm

(%)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%)

CT1(Đ/c) Nước cất vô trùng 15 30 0 100 0

CT2 H2O2 1% 10 30 13,56 64,44 22 CT3 15 30 24,66 62,33 13,01 CT4 20 30 36,66 40,56 22,78 CT5 H2O2 2% 10 30 25 50 25 CT6 15 30 40 30 20 CT7 20 30 49,33 14,65 36,02 CT8 H2O2 3% 10 30 30 12 58 CT9 15 30 64,66 20,45 14,89 CT10 20 30 53,33 6,67 40 LSD05 5,1 CV (%) 7,6

Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.1

Biểu đồ 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ, thời gian khử trùng của H O đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy)

0 13.56 24.66 36.66 25 40 49.33 30 64.66 53.33 0 10 20 30 40 50 60 70 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10

Tỷ lệ mẫu sông không nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu sông không nhiễm (%)

32

Các công thức thí nghiệm đều cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao hơn công

thức đối chứng (0,00%), từ đó cho thấy nồng độ H2O2 và thời gian khử trùng có ảnh

hưởng tích cực đến khả năng tiêu diệt nấm, vi khuẩn. H2O2 có cơ chất tiêu diệt khuẩn

nấm là phá vỡ màng tế bào, không gây độc nhưng nếu mẫu nghiên cứu tiếp xúc ở nồng độ cao và thời gian dài sẽ gây chết mẫu.

- Dung dịch H2O2 ở nồng độ 1% trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm

ở mức độ cao nhất đạt 36,66 % và mức chết khá thấp cao nhất ở mức 22,78%.

- Dung dịch H2O2 ở nồng độ 2% trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm

ở mức độ cao nhất đạt 49,33%, tỷ lệ mẫu sống nhiễm thấp ở mức 14,65% và mức chết khá cao ở mức 36,02%.

- Dung dịch H2O2 ở nồng độ 3% trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống

không nhiễm ở mức độ cao nhất đạt 64,66%, mẫu sống nhiễm và mẫu chết khá thấp lần lượt ở mức 20,45% và 14,89%.

Kết quả thí nghiệm cho thấy dung dịch H2O2 ở nồng độ thấp nhất 1% ít ảnh

hưởng đến mẫu, tỷ lệ mẫu chết cao nhất ở mức 22,78% nhưng hiệu quả khử trùng

thấp. Khi nồng độ H2O2 tăng lên 3% thì hiệu quả của khử trùng của H2O2 khá cao

đạt mức cao nhất 64,66% khử trùng trong 15 phút nhưng khi tăng lên theo thời gian khử trùng lên 20 phút thì tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm mạnh xuống 53,33% và

tỷ lệ mẫu chết khá cao 40%. Điều này cho thấy nếu H2O2 nồng độ và thời gian không

phù hợp thì sẽ không đạt hiệu quả khử trùng tốt nhất.

Nồng độ H2O2 và thời gian khử trùng phù hợp và tốt nhất trong thí nghiệm là

CT9 có H2O2 nồng độ 3% thời gian khử trùng 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống không

nhiễm đạt 64,66% và tỷ lệ mẫu chết ở mức tương đối thấp 14,89%.

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái

sinh đoạn thân mang mầm ngủ lan Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii)

Mẫu sau khi xử lí vô trùng, cấy chuyển sang các môi trường dinh dưỡng có chứa các thành phần khoáng khác nhau để đánh giá khả năng tái sinh chồi lan chồi Hài

33 Chúng tôi thu được kết qủa ở bảng sau:

Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy).

Công thức Môi trường Tổng mẫu nuôi cấy (mẫu) Tổng số mẫu bật chồi (mẫu) Tỷ lệ

tái sinh (%) Chất lượng chồi

1 MS 30 19 63,33 Xanh đậm, mập

2 B5 30 18 60 Xanh nhạt, mập

3 WPM 30 8 26,67 Xanh nhạt, gầy

LDS05 7,5

CV(%) 6,7

Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.2

Biểu đồ 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy).

Kết quả ở bảng 4.2 cho thấy giá trị CV(%) 6.7 và LDS05 đạt 7.5 thì các công

thức đều có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy là 95%.

Xét chỉ tiêu tỷ lệ tái sinh chồi, CT1 (MS) cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất 63.33% tiếp theo CT2 (B5) tỷ lệ tái sinh chồi là 60%. CT3 cho tỷ lệ thấp nhất 26,67%.

Xét chỉ tiêu chất lượng chồi, CT3 (WPM) chồi thu được có màu xanh nhạt và gầy. Trên môi trường MS cho tỷ lệ tái sinh cao nhất trong thí nghiệm trên quan sát

63.33 60 26.67 0 0 10 20 30 40 50 60 70 MS B5 WPM 0 Tỷ lệ tái sinh (%) Tỷ lệ tái sinh (%)

34

và thu được chồi có màu xanh đậm và mập. CT2 là môi trường B5 chất lượng chồi thu được có màu xanh nhạt và mập.

Kết quả thí nghiệm cho thấy chồi cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii)

có thể tái sinh tốt trên nền môi trường chứa hàm lượng dinh dưỡng từ trung bình đến giàu dinh dưỡng. Còn đối với môi trường nghèo dinh dưỡng hạn chế cho sự tái sinh

trưởng và phát triển chồi cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii). Từ kết quả

trên chúng tôi chọn môi trường MS làm môi trường cơ bản cho quá trình nghiên cứu

sau của cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii).

Trong nghiên cứu của tác giả Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) đã sử dụng môi trường RE cho tỉ lệ tái sinh chồi đạt 58% thấp hơn thí nghiệm 2 của chúng tôi. Từ kết quả trên, chúng tôi chọn môi trường MS làm môi trường cơ bản cho quá trình

nghiên cứu sau của cây Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii).

CT1 (Xanh đậm, mập) CT2 (Xanh nhạt, mập) CT3 (Xanh nhạt, gầy)

Hình 4.2. Hình ảnh ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy)

CT1: Môi trường MS, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 63.33%; CT2: Môi trườngg B5, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 60%; CT3: Môi trường WPM, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 26,67%.

4.3. Kết qủa nghiên cứu của một số Cytokinnetin đến khả năng nhân nhanh chồi

Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) từ đoạn thân mang mầm ngủ.

4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii).

35

(nhiệt độ, ánh sáng). Thảo luận ở phần này, lấy từ kết quả nghiên cứu của các tác giả trong phần tổng quan, nhất là bổ sung các chất kích thích sinh trưởng.

Với mục đích nhân nhanh Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) tái sinh,

chúng tôi tiến hành thí nghiệm: mẫu nuôi cấy được thử nghiệm khả năng nhân nhanh chồi sử dụng môi trường có bổ sung BA với nồng độ khác nhau. Thí nghiệm được theo dõi trong 6 tuần.

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 6 tuần nuôi cấy)

Công thức Nồng độ BA (mg/l) Số mẫu đưa vào (mẫu) Tổng số mẫu bật chồi (chồi)

Tỷ lệ tái sinh chồi

(%)

Chất lượng chồi

1 (Đ/c) 0,0 30 9 0,3 Xanh nhạt, gầy

2 1,0 30 23 0,77 Xanh đậm, gầy

3 2,0 30 39 1,3 Xanh đậm, mập

4 3,0 30 25 0,93 Xanh đậm, mập

5 5,0 30 13 0,27 Xanh đậm, gầy

LSD05 0,44

CV% 4,1

Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.3

Biểu đồ 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

0.3 0.77 1.3 0.93 0.27 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0,0 1,0 2,0 3,0 5,0

Tỷ lệ tái sinh chồi (%)

36

Kết quả bảng 4.3 cho thấy giá trị CV (%): 4.1 và LSD05 đạt 0,44 thì công thức

CT3 có sự sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95 % , các CT khác có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này cho thấy BA có sự ảnh hưởng tích

cực tới khả năng tái sinh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii).

Xét chỉ tiêu nhân nhanh chồi, từ CT2 đến CT5 tương ứng với bổ sung BA ở các nồng độ từ 1,0-5,0 mg/l, sau 6 tuần nuôi cấy thì tổng số chồi thu được nhiều hơn so với công thức đối chứng (9 chồi). Trong thí nghiệm này, khi sử dụng BA ở nồng độ 2,0 mg/l (CT3) cho tổng chồi thu được cao nhất (39 chồi) với hệ số nhân chồi là 1,3 lần.

Xét chỉ tiêu chất lượng chồi, khi không bổ sung BA (CT đối chứng) chiều cao chồi tái sinh thấp và chồi nhạt màu. CT2 (nồng độ BA 1,0 mg/l) cho chất lượng chồi tốt nhất (chồi xanh đậm và gầy). CT3 (nồng độ BA 2,0mg/1) cho tỷ lệ tái sinh chồi

cao nhất chồi xanh đậm và mập. Chất lượng chồi giảm khi tăng dần nồng độ BA. Kết quả trên được giải thích như sau: BA là Cytokinnetin có vai trò trong việc

hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ đó sẽ có tác dụng cảm ứng cho việc hình thành chồi và phân hóa chồi. Khi tăng dần nồng độ BA trong môi trường (0 – 2,0 mg/l) thì tỷ lệ chồi tái sinh tăng đáng kể. Nồng độ BA 2,0 mg/l đối với cây Hài Hương Lan

(Paphiopedilum emersonii) cho tổng chồi thu được cao nhất đạt 39 chồi, chất lượng chồi tốt. Khi tăng nồng độ BA lên, tỷ lệ tái sinh có xu hướng giảm dần, điều này có thể giải thích là nồng độ BA thích hợp kích thích cây sinh trưởng, tuy nhiên khi nồng độ BA tăng cao vượt quá ngưỡng cần thiết có thể gây ức chế khả năng tạo chồi.

Trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Tình và cộng sự (2018) trên môi trường MS có bổ sung BA 2,0 mg/l cho hệ số nhân chồi 2,14 lần. So với thí nghiệm 3 của đề tài kết quả của tác giả Nguyễn Thị Tình không có sự chênh lệch đáng kể (< 1%).

Do vậy chúng tôi lựa chọn BA với nồng độ 2,0 mg/l, cho kết quả tốt nhất sẽ được sử dụng nghiên cứu kết hợp với chất kích thích sinh trưởng khác ở các thí nghiệm tiếp theo.

37

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

(Xanh nhạt, gầy) (Xanh đậm,gầy) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, mập) (Xanh đậm, gầy)

Hình 4.3. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 20 ngày nuôi cấy).

CT1: 0 mg/l BA; CT2: 1,0 mg/l BA; CT3: 2,0 mg/l BA; CT4: 3,0 mg/l BA; CT5: 5,0mg/l BA.

4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii)

Cũng như BA, Kinetin (6-furfurolaminopurrine) là một chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Cytokinnetin, được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy mô- tế bào nhằm kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [3]. Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh với nồng độ BA thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi + Kinetin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu. Sau 4 tuần nuôi cấy kết quả được trình bày ở bảng 4.4.

Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả

năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần

nuôi cấy) Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ Kinetin (mg/l) Số mẫu nuôi cấy (mẫu) Tổng số chồi thu được (chồi) Hệ số nhân chồi (lần) Chất lượng chồi CT 1 2,0

0,0 30 27 0,8 Xanh nhạt, gầy

CT 2 0,3 30 18 0,6 Xanh đậm, gầy

CT 3 0,5 30 29 0,97 Xanh nhạt,gầy

CT 4 1,0 30 45 1,23 Xanh đậm, mập

CT 5 2,0 30 30 1,08 Xanh nhạt, mập

LSD05 0,13

38

Kết quả thí nghiệm được biểu hiện qua biểu đồ 4.4

Biểu đồ 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh giống Hài Hương Lan (Paphiopedilum emersonii) (sau 4 tuần

nuôi cấy)

Kết quả thu được ở bảng 4.4 cho thấy: Giá trị CV (%): 9.5 và LSD0.5 đạt 0,13;

cặp công thức CT2 và CT3 không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% và các CT còn lại thì các thí nghiệm đều có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Cho thấy rằng tất cả các công thức có bổ sung nồng độ BA 2,0 mg/l; Kinetin 0 – 2 mg/l vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực tới việc nhân nhanh chồi Hài Hương Lan

(Paphiopedilum emersonii)

Trong thí nghiệm này nồng độ Kinetin 1,0 mg/l cho tổng số chồi thu được là 45 chồi và hệ số nhân cao nhất là 1,23 lần, chồi thu được xanh đậm, mập. Tuy nhiên, nồng độ Kinetin từ 0,3; 0,5; 2,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm với CT2,CT3, CT5 lần lượt là 18 chồi , 29 chồi, 30 chồi tương ứng vợi hệ số nhân là 0,6; 0,97 ; 1,08 lần, chất lượng chồi cũng kém dần xanh nhạt, gầy.

Kết quả thí nghiệm thu được được giải thích như sau: Ở CT đối chứng (CT1) do môi trường nuôi cấy không bổ sung Kinetin nên khả năng tạo chồi thấp hơn so với các công thức có bổ sung Kinetin. Ở CT2, CT3, Kinetin có nồng độ là 0,3 – 0,5 mg/l