Nội dung nghiên cứu

3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam. - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam

3.3.2. Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy mô

- Sử dụng môi trường MS, RE bổ sung Agar 5,5 g/l, Đường 30g/l, Nước dừa 150ml/l, Inositol 100mg/l, 0,5 g/l THT, pH: 5,6 - 5,8.

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng bổ sung vào môi trường nuôi cấy có hàm lượng thay đổi tùy theo từng thí nghiệm.

23

3.4.2. Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích

sinh trưởng đến khả năng tái sinh, nhân nhanh chồi từ phôi và ra rễ của cây lan hài Vân Nam

3.4.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học thực vật (Khoa CNSH-CNTP) trong điều kiện nhiệt độ phòng (25ºC ± 2, độ ẩm 60 – 65%, 14h sáng/10h tối, cường độ chiếu sáng 2000 – 2500 lux.

Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 10 bình, mỗi bình 3 mẫu.

3.4.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam.

- Quả tái sinh từ phôi sẽ hình thành chồi được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền, có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin, TDZ) để theo dõi khả năng nhân quả của mẫu.

- Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân

nhanh chồi từ phôi của cây lan hài Vân Nam.

- Chồi tái sinh được tách và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền (Môi trường nền gồm thành phần khoáng đa lượng, vi lượng,

Nhân nhanh chồi ( môi trường nền có bổ sung BA,kinetin,TDZ ) Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh (Môi trường nền bổ sung lần lượt NAA

và THT )

24

vitamin là thành phần của môi trường MS bổ sung: Đường 30 g/l + Nước dừa 150 ml/l + Agar 5,5 g/l + Inositol 100mg/l + 0,5g/l THT , pH 5,6 – 5,8.), có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (BA) để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

- Theo dõi, quan sát số chồi, chất lượng chồi.

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + BA ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau: CT 1 (Đ/c): MT nền + BA 0,0 mg/l CT 2: MT nền + BA 0,5 mg/l CT 3: MT nền + BA 1 mg/l CT 4: MT nền + BA 1,5mg/l CT 5: MT nền + BA 2 mg/l

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam

Các chồi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A (nồng độ BA thích hợp nhất cho quá trình tái sinh phôi ở thí nghiệm 3) + Kinetin ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1(Đ/c): MT nền + A + Kinetin 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + Kinetin 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + Kinetin 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + Kinetin 1,5 mg/l CT 5: MT nền + A + Kinetin 2,0 mg/l

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng

nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam.

Các chổi được tạo thành từ môi trường tái sinh sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh gồm: Môi trường nền + A + B (nồng độ Kinetin thích

25

hợp nhất cho nhân nhanh chồi đã xác định ở thí nghiệm 4) + TDZ ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng nhân chồi của mẫu.

Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + A + B + TDZ 0,0 mg/l CT 2: MT nền + A + B + TDZ 0,5 mg/l CT 3: MT nền + A + B + TDZ 1,0 mg/l CT 4: MT nền + A + B + TDZ 1,5 mg/l CT 5: MT nền + A + B + TDZ 2,0 mg/l

3.4.3.2. Nội dung 2: Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh lan hài Vân Nam.

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của lan hài

Vân Nam.

- Chồi sinh trưởng tốt và có từ 2 - 3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm: MT nền có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng tạo rễ của mẫu.

- Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT 1 (Đ/c): MT nền + 0,0 mg/l NAA CT 2: MT nền + 0.3 mg/l NAA CT 3: MT nền + 0,5 mg/lNAA CT 4: MT nền + 1,0mg/l NAA CT 5: MT nền + 1,5 mg/l NAA

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính đến khả

năng ra rễ của cây lan hài Vân Nam.

Chồi sinh trưởng và có lá từ 2 - 3 lá thì cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm : MT nền + C (nồng độ NAA thích hợp nhất cho ra rễ đã xác định ở thí nghiệm 6) + THT ở các nồng độ khác nhau để theo dõi khả năng ra rễ của mẫu.

Đưa mẫu vào phòng cây. Quan sát và theo dõi số rễ và chất lượng rễ. Thí nghiệm được bố trí như sau:

26 CT 2: MT nền + C + 0,5 g/l THT CT 3: MT nền + C + 1,0 g/l THT CT4: MT nền + C + 1,5 g/l THT CT 5: MT nền + C + 2 g/l THT

3.5. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu

3.5.1. Thu thập số liệu

- Đếm số mẫu sống không nhiễm, số mẫu sống nhiễm, số mẫu sống nhiễm.

- Đếm số chồi: Đếm tổng số chồi hình thành trên các mẫu cây ban đầuvà nhánh trên một mẫu nuôi cấy ban đầu.

- Đếm số lượng rễ, độ dài của rễ.

3.5.2. Các chỉ tiêu theo dõi

- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu

+ Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm:

Tổng số mẫu sống không nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100

Tổng số mẫu đưa vào (mẫu) + Tỷ lệ mẫu sống nhiễm:

Tổng số mẫu sống bị nhiễm (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sống nhiễm (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

+Tỷ lệ mẫu chết:

Tổng số mẫu chết (mẫu)

Tỷ lệ mẫu chết (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

- Chỉ tiêu theo dõi chồi:

Tổng số mẫu nảy chồi (mẫu)

Tỷ lệ tái sinh chồi (%) = × 100% Tổng số mẫu đưa vào (mẫu)

Tổng chồi thu được

Hệ số nhân chồi (lần) = × 100% Tổng chồi nuôi cấy

27 Chất lượng chồi:

+ Sinh trưởng tốt: Chồi mập, khỏe, xanh.

+ Sinh trưởng trung bình: Chồi mập, khỏe, xanh nhạt. + Sinh trưởng kém: Chồi nhỏ, yếu, trắng vàng.

- Chỉ tiêu theo dõi ra rễ:

Tổng số chồi ra rễ (chồi)

Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = × 100% Tổng số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Tổng số rễ thu được Số rễ trung bình/chồi (rễ) =

Tổng số mẫu cấy Chất lượng rễ:

+ Rễ tốt: Rễ khỏe, dài, có màu trắng.

+ Rễ trung bình: Rễ khỏe, ngắn, có màu trắng hơi vàng. + Rễ kém: Rễ ngắn, nhỏ,màu vàng hoặc màu đen.

3.5.3. Phương pháp sử lý số liệu

Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Microsoft office Excel 2010 và phần mềm IRRISTAT 5.0

28

Phần 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam.

4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy)

Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi từ phôi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy)

Công thức Nồng độ BA (mg/l) Số bình mẫu nuôi cấy (bình) Số bình tái sinh chồi(bình)

Hệ số nhân nhanh chồi

(lần) Chất lượng chồi

1 (Đ/c) 0,0 30 6 0,2 Mới nhú, chiều

cao chồi thấp.

2 0,5 30 56 1,87 Xanh đậm, mập

3 1 30 20 0,67 Xanh, gầy,dài

4 1,5 30 45 1,5 Xanh nhạt, mập

5 2,0 30 21 0,7 Xanh, ngắn

LSD05 0,24

CV% 8,5

Kết quả thí nghiêm được biểu thị qua biểu đồ 4.1:

Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy)

0.2 1.87 0.67 1.5 0.7 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

hệ số nhân nhanh chồi (lần)

29

Kết quả bảng 4.1.1 và biểu đồ 4.1 cho ta thấy giá trị CV (%): 8,5% và LSD05 đạt 0,24 thì các công thức khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều này cho thấy BA có sự ảnh hưởng tích cực tới khả năng tái sinh chồi lan Hài Vân Nam.

Ở chỉ tiêu tỷ lệ tái sinh chồi: CT2 có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 1,87 lần cho chất lượng chồi xanh đâm và mập (kết quả đem lại tốt nhất). Tiếp theo là CT4 đạt 1,5% chất lượng chồi thu được xanh nhạt, mập; CT3 đạt 0,67 lần chất lượng chồi thu được là xanh, gầy, dài; CT5 đạt 0,7 lần chất lượng chồi thu dược xanh, ngắn.

Kết quả trên được giải thích như sau: BA là cytokinin có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ đó sẽ có tác dụng cảm ứng cho việc hình thành chồi và phân hóa chồi. Nồng độ BA 0,5 mg/l (CT2) cho nhiều chồi và có số chồi lớn nhất là do BA ở nồng độ này có tác dụng kích thích sự nhân nhanh chồi lan mạnh nhất đồng thời tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt nhất. Ở CT3; CT4; CT5; nồng độ BA lần lượt là 1mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l cho tỷ lệ tái sinh có xu hướng giảm dần.

Tác giả Dương Tấn Nhựt (2007) [31], Nồng độ BA thích hợp nhất cho tái sinh chồi của lan hài P. delenatii khi nuôi cấy trên môi trường MS là 2,0 mg/l, tỷ lệ tái sinh chồi là 75% sau 30 ngày nuôi cấy.

So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với kết quả nghiên cứu của tác giả trên thấy kết quả nghiên cứu của tôi hoàn toàn phù hợp. Điều này chứng tỏ BA có tác dụng tích cực trong việc nhân nhanh chồi lan Hài nói chung và kích thích nhân nhanh chồi lan Hài Vân Nam nói riêng. Vì vậy công thức bổ sung BA nồng độ 0,5mg/l vào môi trường nền được chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo BA kết hợp với Kinetin.

30

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

(xanh gầy, ngắn) (xanh đậm, mập) (xanh gầy, ngắn) (xanh nhạt, mập) (xanh, gầy)

Hình 4.1. Hình ảnh ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi

lan hài Vân Nam (sau 40 ngày nuôi cấy)

CT1: 0 mg/l ; CT2: 0,5 mg/l BA; CT3: 1 mg/l BA; CT4: 1,5 mg/l BA; CT5: 2 mg/l BA.

4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam

BA có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, có tác dụng cảm ứng cho việc tạo thành chồi và phân hóa chồi vì vậy chúng có khả năng tăng hệ số nhân chồi trong nuôi cấy in vitro.

Kinetin là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenin có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào, duy trì sự sống của mô, định hướng tế bào trong con đường phân

hoá và tăng cường tổng hợp chất diệp lục ở lá cây. Do đó trong thí nghiệm này, tôi sử dụng nồng độ BA 0,5 mg/l thích hợp nhất trong quá trình tái sinh (công thức thích hợp nhất ở thí nghiệm trước kết hợp với kinetin ở các nồng độ để thử nghiệm khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam.

Bảng 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam

Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ Kinetin (mg/l) Số mẫu nuôi cấy (mẫu)

Tổng số chồi thu được

(chồi)

Hệ số nhân chồi (lần)

Chất lượng chồi

CT 1

0,5

0,0 30 47 1,87 Xanh đậm, mập

CT 2 0,5 30 48 1,9 Xanh đậm, mập

CT 3 1,0 30 57 1,96 Xanh đậm, mập

CT 4 1,5 30 67 2,23 Xanh đậm, mập

CT 5 2,0 30 56 1,93 Xanh nhạt, mập

LSD05 0,2

31

Kết quả thí nghiệm được thể hiện qua biểu đồ 4.2:

Biểu đồ 4.2. BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam

Qua bảng 4.2 và biểu đồ 4.2 ta nhận thấy:

Khi bổ sung thêm kinetin vào môi trường nuôi cấy thì kinetin có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng nhân nhanh chồi lan hài. Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy ở các nồng độ từ 0,5 đến 2 mg/l thì hệ số nhân chồi dao động từ 1,87 lần đến 1,93 lần, chất lượng chồi cũng tốt hơn so với khi không bổ sung.

Trong thí nghiệm này nồng độ Kinetin 1,5 mg/l cho tổng số chồi thu được là 67 chồi và hệ số nhân cao nhất là 2,23 lần, chồi thu được xanh đậm, mập. Tuy nhiên, nồng độ Kinetin từ 0,5; 1,0 mg/l thu được tổng số chồi và hệ số nhân giảm với CT2, CT3, lần lượt là 47 chồi, 48 chồi, tương ứng vợi hệ số nhân là 1,9 ; 1,96 lần, chất lượng chồi xanh đậm, mập; nồng độ Kinetin 2 mg/l cho tổng số chồi thu được là 57 chồi và hệ số là 1,93 chồi thu được xanh nhạt, mập.

Kết quả thí nghiệm thu được được giải thích như sau: Ở CT đối chứng (CT1) do môi trường nuôi cấy không bổ sung Kinetin nên khả năng tạo chồi thấp hơn so với các công thức có bổ sung Kinetin. Ở CT2, CT3, Kinetin có nồng độ là 0,5 – 1,0 mg/l làm tăng hệ số nhân chồi nhưng không đáng kể, do nồng độ thấp nên các chồi mẫu hầu như không tiếp xúc với Kinetin trong môi trường nuôi cấy, vì vậy nên mẫu phân chia yếu nên chỉ tạo ít chồi mới. Khi nồng độ Kinetin đạt 1,5 mg/l (CT4), Kinetin

1.87 1.9 1.96 2.23 1.93 1.6 1.7 1.8 1.9 2 2.1 2.2 2.3 CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 Hệ số nhân chồi (lần) Hệ số nhân chồi (lần)

32

kích thích mẫu phân chia mạnh nhất nên số chồi mới sinh ra nhiều nhất. Ở CT5 tương ứng với nồng độ 2,0 mg/l Kinetin hệ số nhân chồi thấp hơn so với CT4. Nồng độ Kinetin thích hợp sẽ kích thích chồi sinh trưởng, tuy nhiên khi nồng độ Kinetin tăng cao, vượt quá ngưỡng cần thiết có thể ức chế khả năng tạo chồi.

CT1 CT2 CT3 CT4 CT5

(xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh đậm, mập) (xanh nhạt, gầy)

Hình 4.2. Hình ảnh BA kết hợp với Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của cây lan hài Vân Nam

CT1: 0,5 mg/l BA+ 0mg/l Kinetin ; 0,5 mg/l BA+ 0,5mg/l Kinetin CT3: 0,5 mg/l BA+ 1mg/l Kinetin; CT4: 0,5 mg/l BA+ 1,5mg/l Kinetin;CT5: 0,5 mg/l BA+ 2mg/l

Kinetin.

4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam

TDZ là cytokinin ít bị phân huỷ bởi emzyme nội sinh so với các cytokinin khác, do đó nó có hoạt tính cao và có thể cho hệ số nhân chồi cao hơn các cytokinin khác. Vì vậy trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng nồng độ BA kết hợp với Kinetin thích hợp nhất trong quá trình nhân nhanh (công thức thích hợp nhất ở thí nghiệm trước) kết hợp với TDZ ở các nồng độ để nghiên cứu ảnh hưởng của BA, Kinetin, TDZ đến khả năng nhân nhanh giống lan hài Vân Nam.

33

Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với Kinetin và TDZ