Ngăn ngừa, làm giảm thiể uô nhiễm và chất độc trong ao

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.8.3. Ngăn ngừa, làm giảm thiể uô nhiễm và chất độc trong ao

Chế phẩm vi sinh trong nuôi tôm có vai trò quan trọng, phân hủy các chất hữu cơ và làm giảm đáng kể lớp bùn nhớt, giảm mùi hôi của nước trong ao. Có thể sử dụng chế phẩm vi sinh từ giai đoạn cải tạo ao nuôi, trong suốt quá trình nuôi. Bên cạnh đó, chế phẩm vi sinh có tính tương thích cao, sử dụng hiệu quả đối với nhiều hình thức nuôi tôm khác nhau, từ quảng canh đến thâm canh, siêu thâm canh (Trần Liên Hà và cs, 2007).

Các vi sinh vật có lợi trong chế phẩm vi sinh không chỉ phân hủy sinh học các chất thải hữu cơ, giảm khí độc mà còn giảm được vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiêu thụ hết thức ăn của chúng. Đây là một lợi thế sinh học đặc biệt của chế phẩm vi sinh, bởi thông thường nếu sử dụng kháng sinh, hóa chất để tiêu diệt vi khuẩn có hại sẽ làm ảnh hưởng đến cả hệ sinh vật có lợi trong ao tôm.

Hiệu quả của một chế phẩm vi sinh được đánh giá theo số lượng vi khuẩn có ích trong 1 đơn vị khối lượng, khả năng vi khuẩn sống lại, số lượng vi khuẩn sống lại và thời gian vi khuẩn tái hoạt động khi được đưa vào ao nuôi tôm (Võ Thị Hạnh và cs, 2004). Bên cạnh đó, để chế phẩm vi sinh đạt hiệu quả cao, cần lưu ý một số yếu tố như tình trạng chất lượng nước, thời điểm sử dụng, liều lượng khi sử dụng...

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phạm vi, đối tượng, nội dung nghiên cứu

2.1.1. Phạm vi nghiên cứu

Các ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại các huyện Phong Điền, Phú Vang, Phú Lộc, rừng ngập mặn Rú Chá (Hương Trà) tỉnh Thừa Thiên Huế

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn quang hợp tía (Purple sulfur bacteria)

2.1.3. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo các nội dung sau:

- Phân lập một số chủng vi khuẩn quang hợp tía từ các ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại tỉnh Thừa Thiên Huế

- Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa và đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía trong các điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau

- Đánh giá khả năng sử dụng sulfide của các chủng vi khuẩn tía trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.2. Môi trường hóa chất

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn tía: DSMZ-27 (g/l) (Đỗ Thị Liên và cs, 2008)

STT Thành phần Hàm lượng (g/l) 1 Yeast extraction 0,2 2 CaCl2.2H2O 0,25 3 NH4Cl 0,34 4 KCl 0,34 5 MgSO4 0,5 6 KH2PO4 0,34 7 Nước cất 1000ml Dung dịch vi lượng STT Thành phần Hàm lượng (g/l) 1 Na2-EDTA 3 2 FeSO4.7H2O 1.1 3 CoCl2.6H2O 0,19

4 MnCl2.2H2O 0,05 5 ZnCl2 0,042 6 NiCl2.6H2O 0,024 7 Na2MoO4.2H2O 0,018 8 H3BO3 0,3 9 CuCl2.2H2O 0,002 10 Nước cất 1000 ml Dung dịch bổ sung STT Thành phần Hàm lượng(g/l) 1 NaHCO3 75 2 Na2S.9H2O 30 3 Vitamin b12 0,05

2.3. Phương pháp nghiên cứu và theo dõi các chỉ tiêu

2.3.1. Phương pháp thu mẩu bùn đáy ao nuôi tôm

- Nguyên tắc lấy mẫu

+ Để đảm bảo mẫu đại diện, các điểm lấy mẫu phải được phân bố ngẫu nhiên trong diện tích điều tra. Điều này tốt nhất được tiến hành theo phương pháp lấy điểm theo đường chéo nếu địa hình đồng nhất và diện tích < 1000 m2 sẽ lấy 5 điểm đại diện.

+ Khi lấy mẩu nên gạt bỏ lớp bùn mỏng ở đáy ao nuôi, sau đó lấy phần mẩu bùn ở phía dưới.

+ Lấy mẫu tốt nhất vào thời gian đáy ao tương đối ổn định, nghĩa là người dân không tác động nhiều vào ao nuôi.

+ Trọng lượng cần lấy khoảng 200gam/ l mẫu

+ Lấy mẫu phân tích VSV phải đảm bảo nguyên tắc là vô trùng, tránh sự nhiễm tạp, lấy xong phải cho mẫu vào túi đựng mẩu, nên bảo quản mẩu trong túi lạnh.

- Vận chuyển mẫu

- Bảo quản mẫu

+ Tốt nhất cần xử lý mẫu và phân tích ngay, nếu không kịp phân tích thì phải bảo quản mẫu ở tủ lạnh, nhiệt độ < 3oC. Mẫu được bảo quản không quá 30 ngày, tốt nhất phân tích càng sớm càng tốt.

2.3.2. Phương pháp pha loảng mẩu nuôi cấy vi khuẩn

- Chuẩn bị 10 bình tam giác hoặc bình cầu có dung tích 100ml hoặc 250 ml. Cho vào mỗi bình 90 ml nước cất hoặc nước muối sinh lý, đánh số thứ tự từ 1 đến 10.

- Muốn đếm được số vi sinh vật dễ dàng, khi phân tích cần pha loãng cơ chất đến một độ nhất định. Cần lưu ý rằng làm dãn mật độ VSV phải pha loãng tỉ lệ luôn luôn = 1/10.

- Cân 10 g cơ chất cho vào bình thứ nhất đã có 90 ml nước vô trùng, lắc 15- 20 phút. Như vậy chúng ta đã có dung dịch pha loãng 10-1, nghĩa là tỉ lệ 1: 10.

- Dùng pipet 10 ml hút 10 ml dung dịch ở nồng độ 10-1 cho vào 90 ml nước ở ống bình thứ 2, lắc đều, chúng ta có nồng độ pha loãng 10-2, tỷ lệ 1:100.

Tiếp tục làm như vậy đối với các bình thứ 3, 4… đến khi chúng ta có được dãy pha loãng cần thiết, tỷ lệ 10-3, 10-4, 10-5….

Hình 2.1. Phương pháp pha loảng mẩu

2.3.3. Nuôi cấy vi khuẩn

- Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn quang hợp từ mẫu bùn đáy được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí trên môi trường chọn lọc DSMZ-27.

- Môi trường DSMZ–27 cải tiến (g/l) (Đỗ Thị Liên và cs, 2008)

Sau 24h nuôi cấy, kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc, dựa vào màu sắc, hình dạng, kích thước khuẩn lạc trên đĩa thạch để chọn ra khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc nghi ngờ là khuẩn lạc chiếm ưu thế trên đĩa thạch).

Mở đĩa thạch có khuẩn lạc nghi ngờ dưới ngọn đèn cồn, dùng que cấy vô trùng lấy bệnh phẩm từ khuẩn nghi ngờ cấy sang đĩa thạch mới. Nuôi cấy đĩa thạch chứa vi khuẩn thuần chủng ở nhiệt độ 30 – 370C trong 24h.

- Tính số lượng vi sinh vật

Mỗi tế bào vi sinh vật trên môi trường thích hợp sẽ phát triển và cho chúng ta một khuẩn lạc.

Số lượng vi khuẩn được tính theo công thức sau:

X=

V A

x K

Trong đó: X: số lượng vi khuẩn/ml

A: Số khuẩn lạc trung bình trên đĩa thạch V: Thể tích nước đưa vào nuôi cấy

K: hệ số pha loảng

2.3.4. Phương pháp làm giàu và phân lập vi khuẩn quang hợp tía

- Nuôi tích lũy

Tiến hành nuôi tích lũy để làm giàu vi khuẩn quang hợp bằng môi trường DSMZ-27 với nguồn cacbon được sử dụng chính là cao nấm men. Vi khuẩn quang hợp tía được làm giàu trong điều kiện kỵ khí và có chiếu sáng sau 5 - 7 ngày quan sát sinh khối vi khuẩn quang hợp tía với màu sắc đặc trưng từ màu cam, màu vàng đến đỏ tía.

- Phân lập và làm thuần

Huyền phù sinh khối vi khuẩn quang hợp tía lấy từ môi trường nuôi tích lũy được pha loãng và ria trên môi trường thạch DSMZ-27. Sau đó đặt đĩa này dưới ánh sáng của bóng đèn sợi đốt 40W, cách 20 cm tới đèn. Sau 5 - 7 ngày, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ, với màu sắc đặc trưng, huyền phù hóa từng khuẩn lạc trong nước cất vô trùng và ria trên môi trường thạch mới để làm thuần vi khuẩn quang hợp.

2.3.5. Quan sát hình thái tế bào

Đặc điểm hình thái của vi khuẩn tía được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2004) và soi dưới kính hiển vi.

Nguyên tắc nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng của fuchsin, vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím của violet.

- Cách tiến hành:

Dùng que cấy lấy mẫu, dàn trải mẫu trên lam kính sau đó cố định mẫu trên đèn cồn. Tiến hành nhuộm bằng dung dịch trong 1 phút rồi rửa với nước cất, phủ dung dịch lugol trong 1 phút, sau đó đổ bỏ dung dịch và rửa nhẹ bằng nước cất. Tẩy cồn trong 15 – 20 giây và rửa lại bằng nước cất sau đó phủ dung dịch fuchsin lên lam kính trong 30 giây, đổ bỏ dung dịch và rửa qua nước. Dùng giấy thấm để thấm hoặc để khô tự nhiên. Khảo sát hình thái tế bào và tính chất bắt màu của vi khuẩn tía dưới kính hiển vi với vật kính dầu.

2.3.6. Xác định khả năng sinh trưởng

Vi khuẩn quang hợp tía được nuôi cấy ở môi trường DSMZ-27 ở điều kiện kỵ khí, có ánh sáng. Cứ sau 2 ngày nuôi cấy, khả năng tích lũy sinh khối của các chủng vi khuẩn tía được xác định bằng phương pháp đo độ đục (∆OD660).

Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Giá trị OD (optical density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trưởng càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 500 – 660nm.

Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn tía bằng máy quang phổ. Cho môi trường vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 660nm, đưa về giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy vi khuẩn tía cho vào cuvet số 2 và cho vào máy đo, đọc kết quả hiện trên màn hình. Các chủng vi khuẩn có tốc độ tăng trưởng cao (giá trị OD660 >0.5) sẽ được tuyển chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

2.3.7. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng PCR

Song song với việc định danh vi khuẩn bằng phản ứng sinh hoá, các chủng vi khuẩn phân lập được định danh bằng phương pháp PCR gồm các bước sau:

- Tách chiết DNA: lấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn quang hợp phân lập được trên đĩa thạch DSMZ-27, bỏ vào 5ml dung dịch DSMZ-27. Nuôi ở nhiệt độ là 28 - 30oC trong vòng 24 giờ. Sau đó ly tâm ở tốc độ 4000 rpm trong 15 phút. Bỏ phần dịch nổi, vi khuẩn thu được rửa bằng nước muối sinh lý 0.85% hai lần. Sau đó cho 1 ml dung dịch đệm TE (Tris - EDTA) vào trộn đều trên Vortex. Sau đó trích ly DNA bằng nhiệt ở nhiệt độ 98oC trong vòng 10 phút. Làm lạnh nhanh bằng nước đá để chấm dứt phản ứng. Ly tâm ở tốc độ 14.000 rpm trong 1 phút. Loại bỏ phần cặn, thu dịch nổi (DNA) và bảo quản ở nhiệt độ -20oC để sử dụng cho PCR.

- Rút phần dung dịch ở trên, đo và xác định hàm lượng DNA bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 260 nm theo công thức:

Hàm lượng DNA (µg/ml) = Giá trị đo ở 260 nm x 50 x độ pha loãng. - Quy trình PCR:

Cặp mồi được sử dụng để khuyếch đại DNA của vi khuẩn quang hợp có trình tự axit nucleic như sau (Đỗ Thị Liên và cs, 2008):

+ Mồi xuôi: 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’ + Mồi ngược: 5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’ - Khuếch đại DNA:

Thành phần hoá chất thực hiện phản ứng PCR gồm 10 X PCR buffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 μM dNTPs, 5U Taq DNA polymerase, 0.4 μM mồi EiFd-1, 0.4 μM mồi EiRs-1, 20 ng DNA mẫu và nước. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng là 95C trong 4 phút, 90C trong 30 giây, 53C trong 45 giây; 72C trong 30 giây lặp lại chu kỳ trên 30 lần, 72C trong 10 phút.

- Đọc kết quả:

Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa 1.5% agarose (Promega). Đọc kết quả dựa vào thang DNA 1 kb plus (Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử.

Sản phẩm PCR được gửi đi phòng thí nghiệm Head Diagnositics institude Manufacturing Centenr, Biochemical Resarch Institude (Hàn Quốc) để giải trình tự nucleotide. Sau đó dung phần mềm BLAST để định danh.

2.3.8 Đánh giá ảnh hưởng của pH và nồng độ NaCl lên sự phát triển của vi khuẩn quang hợp

Ảnh hưởng của pH và nồng độ muối đến sự phát triển của vi khuẩn tía được tiến hành như sau:

Các chủng VK sẽ được nuôi cấy trong môi trường có nồng độ pH lần lượt là: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 và nồng độ NaCl lần lượt là: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35‰. Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 28 – 300C, chiếu sáng liên tục.

2.3.9. Đánh giá ảnh hưởng của cao nấm men đến sinh trưởng của vi khuẩn quang hợp tía

Đánh giá ảnh hưởng của cao nấm men đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía chọn lọc được tiến hành như sau:

Các chủng vi khuẩn quang hợp tía được nuôi cấy trong môi trường DSMZ-27 lỏng, với nồng độ cao nấm men khác nhau: 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0(g/l) ở pH 6,8 -7,0, nhiệt độ 28 – 300C, kỵ khí, có ánh sáng. Nuôi cấy lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía sau 7 ngày bằng cách xác định độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 660nm – OD660 trên máy đo quang phổ.

2.3.10. Xác định khả năng sử dụng sulfide

Chủng VKQH được nuôi cấy trên môi trường DSMZ – 27 lỏng chứa Na2S ở các nồng độ 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30 mg/l ở điều kiện kỵ khí, có ánh sáng. Khả năng sử dụng sulfide của chúng sau một thời gian nuôi cấy nhất định được xác định thông qua hàm lượng sulfide còn lại bằng phương pháp chuẩn độ.

Nguyên tắc: Dùng FeCl3 kết tủa lượng Na2S có trong dịch nuôi cấy vi khuẩn tía. Hòa tan lượng kết tủa trên bằng H2SO4 theo phương pháp chuẩn độ. Từ lượng H2SO4 ta suy ra được hàm lượng sulfide dựa vào đường chuẩn. Đường chuẩn Na2S được xây dựng bằng cách chuẩn độ Na2S ở các nồng độ: 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 mM bằng H2SO4 1N.

Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn tía ở các nồng độ Na2S khác nhau: 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30 mg/l. Sau 5 ngày nuôi cấy, lấy khoảng 20 ml dịch nuôi cấy để chuẩn độ. Cho từng giọt FeCl3 5% để kết tủa hết lượng Na2S có trong dịch nuôi cấy. Dùng H2SO4 1N hòa tan lượng kết tủa trên bằng dụng cụ chuẩn độ, ghi lại lượng H2SO4 1N

đã tiêu tốn. Dựa vào đường chuẩn ta suy ra được lượng Na2S còn lại trong dịch nuôi cấy. Từ kết quả trên ta tính được lượng Na2S vi khuẩn tía đã sử dụng ở mỗi nồng độ.

Biểu đồ 2.1. Đường chuẩn Na2S

2.3.11. Phương pháp xử lý số liệu:

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả thu thập mẩu và nuôi cấy phân lập vi khuẩn quang hợp tía

Nhằm thu được số lượng lớn và thành phần các chủng vi khuẩn quang hợp đa dạng, quá trình thu mẩu đã được thực hiện từ mẩu nước ao nuôi tôm, mẩu bùn đáy ao, mẩu nước tại các ao chứa và nguồn nước thải tại 4 huyện của tỉnh Thừa Thiên Huế. Sau quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn quang hợp tía bằng môi trường DSMZ-27 trong điều kiện kị khí, có chiếu sáng liên tục bằng đèn sợi đốt 40w trong vòng 7 – 10 ngày. Kết quả với 10 mẩu nuôi cấy đã phân lập đươc 08 chủng vi khuẩn (Bảng 3.1) với màu sắc khuẩn lạc và tốc độ tăng trưởng của các chủng này trong môi trường DSMZ-27 lỏng bổ sung 10mg/l Na2S, được thể hiện ở hình 3.1. và bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn quang hợp tía

Địa điểm thu mẫu Điền Lộc Điền Lộc Rú Chá Rú Chá Phú Lộc Phú Lộc Phong Hải Phong Hải

Ký Hiệu mẩu DL11 DL21 RC11 RC21 PL11 PL21 PH11 PH21

Khuẩn lạc

Hình dạng Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Không đều Không đều Tròn

Mép khuẩn Tròn Gợn

sóng Tròn Tròn

Gợn

sóng Gấp nếp Gấp nếp Tròn

Bề mặt Lồi Lồi Lồi Hơi lồi Hơi lồi Lồi Lồi Lồi

Sắc tố Cam nâu Trắng Đỏ Trắng Trắng Trắng Trắng Vàng

Màu sắc Đục Hơi đục Đục Đục Đục Đục Đục Đục