3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ thụ tinh sau
tinh sau ICSI
Tỉ lệ thụ tinh là dấu hiệu đầu tiên để kiểm tra tính hiệu của phương pháp AOA sau kỹ thuật ICSI. Mục tiêu là tăng tỉ lệ thụ tinh thông qua sử dụng phương pháp AOA lên đối tượng bệnh nhân có chất lượng tinh trùng ít – yếu – dị dạng (OAT). Bất thường tinh trùng, trong số 30 trường hợp sử dụng phương pháp AOA có các trường hợp bất thường tinh trùng như sau:
Bảng 3.1: Các trường hợp bất thường tinh trùng trong nghiên cứu
Các trường hợp tinh trùng Số ca Tỉ lệ
Tinh trùng từ phẫu thuật thủ thuật (PESA) đông lạnh 4 14%
Tinh trùng từ phẫu thuật thủ thuật (PESA) tươi 9 30%
Tinh trùng dưới 1 triệu 11 36%
Tinh trùng bất thường đầu trên 80% 6 20%
Bất thường đầu tinh trùng là yếu tố lớn nhất ảnh hưởng tới thụ tinh và chất lượng phôi trong tất cả các loại bất thường tinh trùng. Đối với những trường hợp tinh trùng bất thường đầu, tinh trùng từ mẫu phẫu thuật thủ thuật thường được ưu tiên chỉ định hoạt hóa noãn hơn cả, cụ thể là chiếm 30% trên tổng số ca nghiên cứu. Vì những tinh trùng từ phẫu thuật thủ thuật chủ yếu là những tinh trùng không thể lấy bằng dường xuất tinh bình thường. Khi có chẩn đoán không có tinh trùng trong mẫu tinh dịch (azoospermia) kết hợp với xét nghiệm nội tiết trong ngưỡng
bình thường, bệnh nhân sẽ được chỉ định lấy tinh trùng bằng phương pháp phẫu thuật thủ thuật.
Trong nghiên cứu này là kĩ thuật chọc hút tinh trùng qua da (Percutaneous epidydimal sperm aspiration – PESA). PESA là một phương pháp ít xâm lấn, có thể được thực hiện với gây tê tại chỗ, với tỷ lệ thành công khoảng 65%. Đây là phương pháp có thể thực hiện được nhiều lần, đơn giản hơn và mẫu tinh trùng thu được thường ít lẫn máu và xác tế bào. Do đó, PESA là một trong những phương pháp nên chọn lựa đầu tiên ở những trường hợp không tinh trùng do tắc nghẽn.
Bảng 3.2: So sánh tỉ lệ thụ tinh giữa 2 nhóm noãn điều trị và nhóm đối chứng
Đối tượng Trường hợp Tổng số noãn Tỉ lệ thụ tinh (%) ICSI/AOA 30 284 93% ICSI (Đối chứng) 174 1485 89% P-value 0,022 Độ tin cậy 95%
Số liệu noãn đối chứng được lấy 174 bệnh nhân từ năm 2017 đến 2019 với số noãn trưởng thành là 1485. Có 30 trường bệnh nhân từ tháng 8 năm 2019 đến tháng 8 năm 2020 có bất thường tinh trùng nặng được nhận vào nghiên cứu với số noãn trưởng thành thu được là 284 noãn.
Tỉ lệ thụ tinh của những trường hợp thực hiện kỹ thuật AOA là 93%, cao hơn tỉ lệ thụ tinh của những trường hợp không thực hiện (89%), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Mohammad và cs. (2008) khi nhóm nghiên cứu sử dụng AOA chỉ ra tỉ lệ thụ tinh là 66,7% cao hơn nhóm đối chứng là 52,7%, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P<0,05)
[28]. Nghiên cứu mới nhất về việc sử dụng calcium ionophore của Takisawa và cs. (2011) trên 85 cặp vợ chồng đã từng thất bại trong điều trị IVF, kết quả cho thấy tỉ lệ thụ tinh của noãn ở chu kỳ IVF có sử dụng AOA cao hơn nhiều so với noãn ở chu kỳ IVF trước (62,5% so với 20,9%, P <0,01) [47].
Đồng thời cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của Ebner và cs năm 2012 đánh giá kết quả sau ICSI. Kết quả cho thấy tỉ lệ thụ tinh ở nhóm ICSI-AOA cao hơn so với nhóm ICSI không AOA và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê [14]. Tương tự với nghiên cứu của Okuyama N. và cs. (2015) kết quả tỉ lệ thụ tinh ở nhóm ICSI-AOA cũng cao hơn so với nhóm ICSI đối chứng (67,8% so với 21,4%) [34]. Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy AOA giúp cải thiện tỉ lệ thụ tinh [15], [48], [42].
3.2. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến chất lượng phôi hữu dụng ngày 3
Bảng 3.3: So sánh chất lượng phôi ngày 3 giữa nhóm bệnh nhân sử dụng phương pháp AOA và đối chứng
Đối tượng
Tỉ lệ noãn thụ tinh lên phôi
ngày 3 (%)
Chất lượng phôi ngày 3
Rất tốt Tốt TB Số phôi Tỉ lệ (%) Số phôi Tỉ lệ (%) Số phôi Tỉ lệ (%) Số phôi Tỉ lệ (%) ICSI/AOA 260/263 99% 58 22% 107 41% 45 17% ICSI (Đối chứng) 1280/1315 99% 243 19% 447 35% 255 20% P-value 0,238 0,063 0,316 Độ tin cậy 95%
Trong đánh giá chất lượng phôi, có 4 mức đánh giá, tuy nhiên phôi hữu dụng chỉ nằm ở ba mức rất tốt, tốt, trung bình. Vì vậy, số liệu ở bảng 3.3 chỉ bao gồm đánh giá 3 chất lượng phôi ngày ba. Từ bảng 3.3 cho thấy tỉ lệ phôi loại 1 (rất tốt) ở trường hợp noãn nghiên cứu (22%) cao hơn ở những noãn đối chứng (19%) tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Đồng thời tỉ lệ ở phôi loại 2 (tốt) cũng cho kết quả tương tự là phôi nghiên cứu AOA cho tỉ lệ cao hơn (41%) so với phôi không sử dụng AOA (35%), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Kết quả ở phôi loại 3 (trung bình) cũng cho thấy tỉ lệ phôi loại 3 ở noãn AOA thấp hơn (17%) so với noãn không AOA (20%). Tuy vậy, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê.
Kết quả trên cũng tương đồng với nghiên cứu của N.T.T.Lan và cs (2011), tác giả ghi nhận thấy tỉ lệ phôi tốt ở nhóm nghiên cứu có xu hướng cao hơn nhóm đối chứng, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (54,3% so với 53%) (P > 0,05) [2].
Bên cạnh chất lượng phôi tại thời điểm giai đoạn ngày 3 thì yếu tố động học của phôi cũng là một trong những tiêu chí để quyết định phôi chuyển. Quan sát động học từ giai đoạn thụ tinh đến giai đoạn phôi ngày 3 sẽ cho thấy những phân chia bất thường của phôi mà hình ảnh phôi giai đoạn ngày 3 không thể phản ánh. Đã có nhiều công bố nghiên cứu về ảnh hưởng của kỹ thuật AOA bằng hóa chất lên động học phát triển của phôi. Trong đó có nghiên cứu của Okuyama N. và cs. (2015) tiến hành phân tích trên 29 bệnh nhân có tiền căn thụ tinh kém nhằm đánh giá tác động của AOA đến động học của phôi. Kết quả tỉ lệ thụ tinh ở nhóm ICSI- AOA cao hơn so với nhóm ICSI (67,8% so với 21,4%). Những phôi có AOA, hình ảnh ghi nhận bằng camera quan sát liên tục cho thấy sự hòa nhân của hai tiền nhân và lần phân bào đầu tiên diễn ra nhanh hơn so với nhóm không AOA. Tuy nhiên, các thông số động học khác không có sự khác biệt giữa hai nhóm [34].
Một nghiên cứu vừa công bố gần đây nhất của Ebner và cs. (2018) phân tích nhóm bệnh nhân có tiền sử thụ tinh kém, đánh giá kết quả giữa một nửa số noãn
ICSI-AOA bằng A23187 và một nửa số noãn không AOA. Kết quả cho thấy tỉ lệ thụ tinh ở nhóm ICSI-AOA cao hơn so với nhóm ICSI (62% so với 24%). Các thông số động học phát triển khác của phôi cũng không ghi nhận có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Như vậy, AOA có thể ảnh hưởng đến giai đoạn đầu của quá trình phân bào tuy nhiên không ảnh hưởng đến các giai đoạn sau, cụ thể là động học phát triển của phôi [13].
Bên cạnh đó, đánh giá mức độ ảnh hưởng của AOA lên sự phân chia nhiễm sắc thể cũng là một vấn đề cần lưu ý. Năm 2016 Capalbo và cs. đã thực hiện đánh giá phân tử trên 66 noãn MII sau ICSI. Noãn được hiến tặng từ 12 bệnh nhân, hoạt hóa bởi calcium-ionophore (A23187). Những noãn sau khi được hoạt hóa được phân tích NST bằng kỹ thuật array CGH và phân tích SNP. Noãn đối chứng là những noãn thụ tinh bình thường. Kết quả, 49 noãn còn sống và 39 noãn (79,6%) được hoạt hóa. Hầu hết noãn được hoạt hóa đều có kết quả bình thường, đánh giá qua việc tống xuất thể cực thứ hai và hình thành một hay không có tiền nhân (2PB1PN: 76,9% và 2PB0PN: 12,8%). 27 noãn được mang đi xét nghiệm và kết quả có 16 noãn (53,9%) là nguyên bội. Dựa trên số liệu NST, có 603 nhiễm sắc thể phân chia bình thường trong kỳ giảm phân II trên tổng số 621 nhiễm sắc thể được phân tích (97,1% cho 2PB0PN và 97,5% cho 2PB1PN) [8]. Như vậy, các số liệu trên cho thấy sử dụng AOA không ảnh hưởng đến quá trình phân chia nhiễm sắc thể trong giảm phân II.
Thụ tinh là cơ sở để hợp tử phân chia và tạo thành phôi, từ đó ảnh hưởng rất lớn đến số lượng phôi chuyển và tỉ lệ có thai lâm sàng trong IVF.
Khoảng 24-26 giờ sau khi diễn ra sự thụ tinh giữa noãn và tinh trùng, hợp tử bắt đầu phân chia đầu tiên đối xứng qua trục. Trung thể của tinh trùng kiểm soát sự phân chia đầu tiên sau thụ tinh [12]. Trong chu kỳ phân bào đầu tiên ở giai đoạn cuối, bào tương của hợp tử kéo dài ra và thắt lại dần ở giữa cho đến khi hợp tử phân chia thành hai phôi bào, quá trình này tiếp tục trong những chu kỳ phân bào tiếp theo. Trong 3 chu kỳ phân bào đầu tiên, kích thước của phôi thường ít thay đổi. Phôi có 2 đến 8 phôi bào phụ thuộc chủ yếu vào sự dịch mã (translation) từ các chất liệu RNA của mẹ để phân chia [33].
Những bất thường hình thái trong quá trình phát triển phôi làm giảm khả năng làm tổ [18], [56].
Mảnh vụn tế bào: Mảnh vụn được tạo ra do các phôi bào luôn thay đổi hình dạng, các phôi bào tiếp xúc hoặc không tiếp xúc với nhau trong quá trình phân chia, vì vậy tạo nên những mảnh vụn tế bào sau phân chia.
Phôi bào đa nhân: Phôi bào đa nhân có thể xuất hiện ở bất kỳ chu kỳ phân chia nào từ 2 phôi bào đến giai đoạn phôi nang, nhưng quan sát rõ ở giai đoạn phôi phân chia.
Kích thước phôi bào không đều: Một trong những nguyên nhân làm kích thước phôi bào không đều là do sự phân chia không đồng bộ và thiếu cân đối hoặc 1 hay nhiều phôi bào ngừng phân chia.
Tốc độ phân chia phôi: Tốc độ phân chia có liên quan đến khả năng sống của phôi. Phôi phân chia chậm thường có khả năng làm tổ kém hơn. Phôi khỏe mạnh có tốc độ phân chia vào khoảng 18-20 giờ (2 phôi bào sau 24 giờ thụ tinh, 4 phôi bào sau dưới 48 giờ và 8 phôi bào hoặc hơn trước 72 giờ). Phôi phân chia chậm thường có khả năng làm tổ và sinh sống thấp hơn phôi phát triển bình thường. Vì vậy khi đánh giá lựa chọn phôi, chuyển viên phôi thường kết hợp các yếu tố: tốc độ phát triển phôi, hình thái của phôi như số lượng mảnh vụn, độ phát triển của phôi bào, và số lượng nhân tế bào.
3.3. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ lên phôi ngày 5 và chất lượng phôi ngày 5
3.3.1. Tỉ lệ lên phôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng
Phôi nuôi ngày 5 hiện nay tại trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện A chủ yếu là phôi nuôi thụ động, nghĩa là các phôi tốt được ưu tiên lưu giữ lại giai đoạn ngày 3. Các phôi chất lượng kém hoặc trường hợp bệnh nhân có nhiều phôi sẽ được tư vấn theo dõi phôi đến giai đoạn ngày 5.
Đồ thị 3.1: Chất lượng phôi nuôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng Do nuôi phôi dài ngày cho nguy cơ mất phôi rất cao, các yếu tố ảnh hưởng đến phôi giai đoạn ngày 5 bao gồm rất nhiều yếu tố như môi trường nuôi cấy, tủ cấy, chất lượng phôi, chất lượng khí nuôi cấy,...trong điều kiện in vitro, người ta ghi nhận có khoảng 50% - 70% phôi người khi nuôi cấy không thể phát triển đến giai đoạn phôi nang [20], [21]. Do vậy, có sự không tương đồng giữa chất lượng phôi trong hai nhóm nghiên cứu và đối chứng. Tuy nhiên nhìn chung có thể thấy chất lượng phôi loại 1 chiến rất ít (5% và 10%) trên tổng số phôi nuôi, và phôi chất lượng xấu (loại 4) chiếm cao nhất (36% và 45%).
5% 10% 35% 26% 22% 19% 36% 45% N G H I Ê N C Ứ U Đ Ố I C H Ứ N G
Bảng 3.4: So sánh tỉ lệ lên phôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng
Đối tượng Tổng số phôi lên
ngày 5 Tỉ lệ
ICSI/AOA 113 39%
ICSI (Đối chứng) 741 33%
P-value 0,212
Độ tin cậy 95%
Từ kết quả nghiên cứu trong bảng 3.4 có thể thấy tỉ lệ lên phôi ngày 5 của phôi trong nhóm nghiên cứu có sử dụng kỹ thuật AOA cho tỉ lệ lên phôi cao hơn (39%) so với nhóm đối chứng không sử dụng kỹ thuật AOA (33%) với P > 0,05. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên trong tỉ lệ phôi nuôi từ 3 ngày có thể thấy tỉ lệ phôi tốt của 2 nhóm là như nhau, phôi xấu (loại 4) của nhóm đối chứng lại cao hơn. Trong đó, một yếu tố hết sức quan trọng của phôi ngày 5 là chất lượng phôi nuôi từ ngày 3. Những phôi ngày 3 chất lượng tốt được đánh giá bằng hình ảnh phôi cũng có sự tương đồng nhất định với sự bất thường bộ gene của phôi [51].
Ở người phôi dâu bắt đầu hình thành khi phôi ở giai đoạn 8 phôi bào và có tính toàn năng (toptipotent), bằng chứng là khi tiến hành chẩn đoán trước làm tổ, nếu sinh thiết một hoặc hai phôi bào thì phôi vẫn có khả năng phát triển tiếp và bắt đầu quá trình nén (compaction). Quá trình phôi nén hình thành các liên kết chặt chẽ giữa các phôi bào, phần phôi bào tiếp xúc với nhau tăng lên và tạo thành một khối. Khi phôi bắt đầu kết đặc lại, các phôi bào tương tác với nhau làm các phôi bào không còn tính toàn năng (totipotency) và đây là sự khởi đầu cho sự sao mã DNA của phôi.
Trong quá trình hình thành phôi nang, 2 loại phôi bào được hình thành là tế bào phôi ICM (inner cell mass) và tế bào lá nuôi TE (trophectoderm). Tế bào lá nuôi là loại tế bào được biệt hóa đầu tiên trong quá trình hình thành thai. Hai loại tế bào này ngày càng khác nhau khi chúng di chuyển tới các vị trị mới trong quá trình tạo nang. Tế bào lá nuôi có hình bầu dục và phân cực (polarization) trong khi đó tế bào phôi vẫn giữ hình tròn và hình thái không thay đổi. Các tế bào lá nuôi nối với nhau qua những phần tiếp xúc bề mặt nhỏ, trong khi đó tế bào phôi tiếp xúc chặt chẽ với nhau tạo thành một khối. Vị trí và sự phát triển của tế bào lá nuôi và tế bào phôi phụ thuộc vào sự phân cực và sự hình thành trục phân bào của phôi được hình thành từ khi noãn mới bắt đầu được thụ tinh. Các tế bào phôi di chuyển về phía một cực của phôi gọi là cực phôi (embryonic pole), các phôi bào này liên kết chặt với nhau và có đặc tính đa năng (pluripotent). Các tế bào lá nuôi tạo thành hàng rào bên ngoài bảo vệ mầm phôi và được biệt hóa để thực hiện chức năng này [40]. Để đảm bảo phôi phát triển và làm tổ, số lượng phôi bào của phôi nang và tỷ lệ giữa số lượng tế bào phôi và số lượng tế bào lá nuôi được chi phối và điều hòa bởi hệ thống gen. Sau giai đoạn nén, vào cuối ngày thứ tư sau khi thụ tinh, phôi bắt đầu nở rộng và tạo nang dịch bên trong. Các phôi bào bắt đầu biệt hóa và phát triển thành hai dòng thế bào với hình dạng và chức năng khác nhau. Cụ thể, các tế bào ở lớp ngoài cùng của phôi bắt đầu liên kết với nhau và tạo thành một lớp tế bào biểu mô dày. Lớp tế bào bên ngoài này được gọi là lớp tế bào lá nuôi (Trophectoderm - TE), đồng thời 2 đến 4 lớp tế bào ở lớp trong cùng của phôi phân chia và phát triển thành khối tế bào nội mô (Inner cell mass - ICM) (hình 3.3). Quá trình tạo nang bao gồm sự tích lũy dịch vận chuyển bởi các tế bào lá nuôi.
Hình 3.2. Hình ảnh phôi nang
Sự hình thành và phát triển phôi nang phụ thuộc vào một số yếu tố: chất lượng tinh trùng, tuổi của mẹ cũng như các yếu tố khác liên quan đến sự phát triển của phôi ở giai đoạn trước đó như: Số lượng noãn thu được, số lượng noãn thụ tinh, số lượng hợp tử, và số lượng phôi phát triển đến giai đoạn 8 phôi bào vào ngày 3