phẩm (não gà) nghi bệnh
- Bước 1: Gây nhiễm huyễn dịch não của gà trong đàn nghi bệnh vào xoang niệu của phôi gà 10 - 12 ngày đang phát triển.
Lấy não của gà trong đàn xảy ra bệnh Newcastle nghiền và pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10. Khử tạp khuẩn bằng kháng sinh rồi tiêm vào phôi thai gà 10 - 12 ngày, tiêm 0,2 ml cho mỗi phôi vào xoang niệu, ấp tiếp ở 370C 2 - 4 ngày. Hàng ngày soi trứng để phát hiện phôi chết và ghi lại thời gian gây chết phôi. Những phôi gà chết, lấy ra để ở tủ lạnh 0- 40C/6h cho mạch máu co lại và nước trứng trong. Sau đó mổ trứng thu nước trứng và kiểm tra bệnh tích trên phôi. Thử vô trùng nước trứng bằng cách cấy vào các môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu. Bảo quản nước trứng trong tủ lạnh âm.
- Bước 2: Tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (Haemagglutintion Test) xác định sự có mặt của virus Newcastle trong nước trứng sau khi gây nhiễm huyễn dịch não của gà trong đàn nghi bệnh (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2010).
- Nguyên liệu: + Hồng cầu gà 1%
+ Nước trứng có chứa virus sau khi gây nhiễm huyễn dịch não của gà trong đàn xảy ra bệnh (đã chuẩn bị ở bước 1).
+ Nước sinh lý vô trùng.
+ Bơm tiêm, kim tiêm để hút nước trứng.
mổ trứng, bộ đồ mổ trứng, hộp lồng, ống hút, ống nghiệm, giá ống nghiệm, panh, kẹp …), hóa chất (Xitrat natri, cồn-Iod).
* Chuẩn bị:
- Hồng cầu gà 1%:
Lấy 10ml máu tim của gà khỏe mạnh +5ml xitrat natri 5% để chống đông. Ly tâm 3000 vòng/ phút, trong vòng 10 phút. Hút nước trong ở phía trên bỏ đi, thu lấy hồng cầu. Cho nước sinh lý vào rửa hồng cầu, ly tâm rồi hút bỏ phần nước trong ở trên (làm như vậy 3 lần). Cuối cùng được hồng cầu đặc.
Lấy hồng cầu đặc pha với nước sinh lý thành hỗn dịch 1%. * Tiến hành phản ứng:
Phản ứng được tiến hành trên tấm nhựa ngưng kết (Microplates) có 96 lỗ đáy chữ U hoặc đáy chữ V.
Cho các thành phần vào dãy phản ứng theo sơ đồ sau:
- Dùng micropipet nhỏ vào các giếng, từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 10, mỗi giếng 50µl nước sinh lý. Sau đó cho vào giếng thứ nhất 50µl nước trứng chứa virus, trộn đều rồi hút sang giếng thứ hai 50µl. Trộn đều rồi hút từ giếng thứ 2 sang giếng thứ ba 50µl. Tiếp tục làm như vậy cho đến giếng thứ 10, trộn đều rồi hút bỏ đi 50µl.
Như vậy độ pha loãng nước trứng (Hiệu giá virus) thứ tự từ giếng 1 đến giếng 10 lần lượt là 1/2; 1/4; 1/8, 1/16, 1/32. 1/64…1/1024.
- Nhỏ hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng, mỗi giếng 50µl.
- Lắc đều tấm nhựa ngưng kết, để ở nhiệt độ phòng, sau 20 phút đọc kết quả.
* Kết quả:
- Phản ứng dương tính: Hồng cầu ngưng kết thành những hạt lấm tấm nằm rải đều trên bề mặt đáy giếng như hình cái dù lộn ngược, giống như ở giếng đối chứng dương. Hiệu giá đọc ở giếng ngưng kết cuối cùng (trước ống không ngưng
kết). Thí dụ ngưng kết ở giếng thứ 6 thì hiệu giá ngưng kết là 1/64.
Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, nước ở trên trong, giống như ở giếng đối chứng âm.
Bảng 3.1. Sơ đồ tiến hành phản ứng HA 50 50 50 50 50 50 50 50 50 bỏ đi 50µ1 Giếng số Nguyên liệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đối chứng (-) (+) Nước sinh lý (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Nước trứng chứa virus (µl) 50 50 Hiệu giá virus 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Hồng cầu gà 1% (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50