a. Lựa chọn quần thể tế bào phù hợp nhất cho bảo quản lạnh
Tiến hành bảo quản lạnh 150 mẫu và chia làm 3 nhóm. Nhóm A gồm 72 mẫu được bảo quản ngay sau khi phân lập; nhóm B gồm 68 mẫu được bảo quản sau khi nuôi cấy ở giai đoạn chưa cấy chuyển và nhóm C gồm 10 mẫu được bảo quản ở giai đoạn cấy chuyển lần 1. Sau rã đông thu được một số kết quả sau:
Commented [M21]: Vấn đề là
- KQ nuôi cấy tăng sinh: thời gian, đặc điểm, môi trường… - KQ nuôi cấy biệt hoá: thời gian, đặc điểm, qui trình, môi trường - Định danh tính gốc sau tăng sinh
Bảng 3.5. Tỷ lệ sống của các tế bào thần kinh sau rã đông Nhóm Số mẫu
(n= 150)
Tỷ lệ sống
(%) p
Sau phân lập (A) 72 66,6 ± 11,6 p(A−B) = 0,1> 0,05
𝐩(𝐀−𝐂)=0,000< 0,001
𝐩(𝐁−𝐂)=0,000< 0,001
Chưa cấy chuyển – P0 (B) 68 69,8 ± 11,4 Sau cấy chuyển lần 1 – P1 (C) 10 19,9 ± 8,2 Tỷ lệ sống trung bình (%) 64,9
- Tỷ lệ sống sau bảo quản lạnh của nhóm A và nhóm B khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.
- Tỷ lệ sống sau bảo quản lạnh của nhóm C thấp hơn có ý nghĩa thống kê với 2 nhóm còn lại với p <0,001.
- Tỷ lệ sống trung bình của các mẫu là 64,9%.
b. Tỷ lệ sống của tế bào theo thời gian bảo quản
So sánh tỷ lệ sống của tế bào trong 140 mẫu bảo quản lạnh ở nhóm A và nhóm B theo thời gian thu được kết quả sau:
Bảng 3.6. Đánh giá tỷ lệ sống của tế bào theo thời gian
Nhóm Số mẫu (n) Tỷ lệ sống (%) p
Sau bảo quản 2 tuần 35 65,54 ± 10,63
P=0,162 >0,05
Sau bảo quản 1 tháng 35 71,69 ± 11,20
Sau bảo quản 3 tháng 35 67,51 ± 11,84
Sau bảo quản 6 tháng 35 67,91 ± 12,28
Tổng 140 68,16 ± 11,60
Tỷ lệ sống của tế bào sau bảo quản 2 tuần, 1 tháng, 3 tháng và 6 tháng lần lượt là 65,54%; 71,69%; 67,51%; 67,91%. Tuy có khác nhau nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
c. Nuôi cấy tăng sinh các tế bào sau bảo quản lạnh
Các mẫu tế bào sau rã đông được nuôi cấy tăng sinh, kết quả mọc mẫu thể hiện ở biểu đồ 3.2:
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ mọc mẫu nuôi cấy sau rã đông
Tỷ lệ mọc mẫu của nhóm A và nhóm B là tương đương nhau với p > 0,05. Tỷ lệ mọc mẫu trong nhóm C thấp hơn có ý nghĩa thống kê với 2 nhóm còn lại với p <0,001.
d. Định danh các tế bào nuôi cấy sau bảo quản lạnh
Theo dõi sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy sau rã đông, quan sát được hình ảnh các tế bào bắt đầu bám đáy nuôi cấy vào ngày thứ 2. Các tế bào nhỏ, một số bắt đầu xuất hiện nhánh bào tương (Hình 3.20A). Trong những ngày tiếp theo, các tế bào tiếp tục tăng sinh, dần dần kín giếng nuôi cấy. Một số tế bào có xu hướng tạo cụm nơron (Hình 3.20B). Nhuộm Giemsa các mẫu để đánh giá hình thái tế bào, cũng quan sát được hình ảnh nhiều tế bào hình đa diện, có nhiều nhánh bào tương nối với nhau thành mạng lưới. Những tế bào này dương tính với marker vimentin khi nhuộm hóa mô miễn dịch (Hình 3.20C, D): 89,1% 88,2% 10,0% 10,9% 11,8% 90,0% 0 20 40 60 80 Nhóm A Nhóm B Nhóm C Số mẫ u Không mọc Mọc * * (*): p < 0,001
Hình 3.20. Hình ảnh tế bào nuôi cấy sau rã đông
(A) Ngày 2 sau nuôi cấy (KHV soi ngược x100); (B) Ngày 7 sau nuôi cấy (KHV soi ngược x200); (C) Ngày 7 sau nuôi cấy (Giemsa x400);
(D) Nhuộm marker Vimentin (màu đỏ) (KHV huỳnh quang x500).