- Đảm bảo an toàn tuyệt đối cho con người.
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh vi sinh vật:
-Phƣơng pháp truyền thống - Sử dụng các bộ Kit
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Mỗi loại vi khuẩn khác nhau có nhu cầu sử dụng những chất khác nhau, và khi sử dụng các chất này chúng tạo nên những
sản phẩm chuyển hóa khác nhau.
Ví dụ:
Vi khuẩn Salmonella lên men đƣờng glucose, không lên men đƣờng lactose, sinh hơi, sinh H2S.
Vi khuẩn E.coli lên men đƣờng glucose, lên men đƣờng lactose, sinh hơi, không sinh H2S.
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA1 1 Nguồn thức ăn có nitơ 2 Nguồn thức ăn có carbon 3 Enzyme Những phản ứng liên hệ đến:
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có nitơ
• Phản ứng Indol: Một số vi khuẩn (E.coli) có enzyme Tryptophanase chuyển đƣợc tryptophan thành Indol.
Nuôi cấy vi khuẩn trong nƣớc pepton không chứa đƣờng sau 18 - 24 giờ ủ ở 37oC, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Kovac’s (para dimethyl amino benzaldehyt trong rƣợu isoamyl và HCl), màu đỏ xuất hiện trong vòng 5 phút cho biết phản ứng dƣơng tính.
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có nitơ
Phản ứng phân giải urê:
Vi khuẩn có enzyme urease làm phân giải urê và tạo thành NH3.
CO (NH2)2 + H2O → CO2 + 2NH3
NH3 kiềm hóa môi trƣờng đổi chỉ thị màu đỏ phenol thành màu đỏ cánh sen.
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon
Khả năng lên men đường: Trong quá trình phát triển, vi khuẩn có thể lên men đƣờng và tạo thành acid làm đổi chỉ thị màu đỏ phenol từ màu đỏ sang màu vàng.
Cấy vi khuẩn vào ống chứa pepton, cao thịt, 1% đƣờng và chỉ thị màu, phản ứng dƣơng tính khi môi trƣờng chuyển sang màu vàng.
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon
Khả năng lên men đường: Trong quá trình phát triển, vi khuẩn có thể lên men đƣờng và tạo thành acid làm đổi chỉ thị màu đỏ phenol từ màu đỏ sang màu vàng.
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon
Phản ứng đỏ methyl (MR, Methyl Red): Vi khuẩn (E.coli) có khả năng lên men glucose sinh ra hỗn hợp nhiều acid làm cho pH của môi trƣờng giảm ≤ 4,5, phát hiện bằng chỉ thị đỏ methyl, chỉ thị này đổi màu đỏ lúc pH ≤ 4,5.
Nuôi cấy vi khuẩn ở môi trƣờng MR – VP, sau 24 giờ thêm 3 giọt đỏ methyl. Phản ứng dƣơng tính lúc môi trƣờng trở thành màu đỏ.
-+ +
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon
Phản ứng Voges-Proskauer (VP): Một số vi khuẩn (Enterobacter aerogenes) có khả năng lên men glucose, sản phẩm chuyển hóa ngoài acid còn có acetoin, hợp chất này bị khử oxy tạo thành diactyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu với thuốc thử VP. Nuôi cấy vi khuẩn ở môi trƣờng MR - VP, sau 24 giờ thêm vài giọt thuốc thử. Để ở phòng thí nghiệm trong 30 phút, không đậy nắp ống nghiệm, phản ứng dƣơng tính làm xuất hiện màu đỏ eosin.
-+ +
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến nguồn thức ăn có carbon
Khả năng sử dụng Citrate: Khác với E.coli, các loài Klebsiella và
Enterobacter sử dụng Citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất.
Cấy ria vi khuẩn trên ống thạch nghiêng Citrate Simmons chứa chỉ thị màu xanh bromothymol. Sau 24 giờ vi khuẩn sử dụng Citrate để phát triển và do đó làm kiềm hóa môi trƣờng. Phản ứng dƣơng tính: môi trƣờng chuyển từ màu lục sang màu xanh dƣơng.
-+ +
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến enzyme
Khả năng tạo thành H2S:
Nhiều vi khuẩn sử dụng những hợp chất có chứa S thiosulfat thì có thể tạo thành H2S. H2S phản ứng với FeSO4 ở trong môi trƣờng và tạo thành FeS màu đen.
FeSO4 + H2S → FeS↓ + H2SO4
Ở phòng xét nghiệm ngƣời ta thƣờng khảo sát khả năng tạo thành H2S ở môi trƣờng KIA chứa FeSO4 và Na2S2O3.
-+ +
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến enzyme
Thử nghiệm catalase: một số vi khuẩn có khả năng sinh catalase là enzyme thủy phân H2O2 làm xuất hiện oxy => sủi bọt khí.
H2O2 Catalase H2O + ½O2
Phản ứng này đƣợc ứng dụng để phân biệt tụ cầu và liên cầu cũng nhƣ nhận biết những vi khuẩn khác.
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến enzyme
Thử nghiệm coagulase: coagulase là enzyme do một số loài vi khuẩn tiết ra có thể làm đông huyết tƣơng ngƣời và thỏ. Thử nghiệm coagulase đƣợc ứng dụng để xác định tụ cầu gây bệnh.
CÁC KỸ THUẬT SINH HÓA
Những phản ứng liên hệ đến enzyme
Thử nghiệm Oxydase: một số vi khuẩn có enzyme Oxydase. Trong không khí enzyme này phản ứng với thuốc thử p - phenyenendieamine để tạo thành một hợp chất indolphenol có màu xanh dƣơng (hoặc tím).
Thử nghiệm này đƣợc sử dụng để nhận biết lậu cầu, cầu khuẩn màng não, phẩy khuẩn tả…
Các phƣơng pháp cấy khuẩn