Các thành phần hydrocarbon thơm có trong dịch ni cấy vi khuẩn được đem đi phân tích hóa học bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Agilent 1100 (Mỹ) được trang bị detectơ chuỗi (DAD) Điều kiện đo: cột sắc ký Hypersil C 18 (200 × 4 mm), tỷ lệ pha động axetonitril/nước = 67/33 (theo thể tích); tốc độ dịng: 0,6ml/phút; áp suất: 280 bar; tín hiệu đo phenol: 271 nm; toluene: 261 nm; naphthalene: 280 nm; pyrene: 336 nm Hàm lượng phenol, toluene, naphthalene, pyrene được xác định theo phương pháp ngoại chuẩn
Các mẫu phân tích được gửi phân tích tại viện Cơng nghệ mới – Viện Khoa học và Công nghệ quân sự
Hàm lượng dầu diesel được xác định bằng phương pháp phân tích kh ối lượng theo tiêu chu ẩ n TCVN 4582-88:100 ml được hòa tan trong 15 ml dung môi
chloroform, l ắ c nh ẹ (kho ả ng 10 phút) cho d ầ u tan hồn tồn (q trình chi ết đượ c tiế n hành 3 l ần) Khi đó dầ u và dung mơi s ẽ tách làm 2 l ớ p, dùng ph ễ u chi ế t b ỏ phầ n dung môi ở dưới đi Phầ n d ịch hòa tan còn l ại được cô bay hơi bằ ng b ế p cách cát cho t ới c ạ n và cân kh ối lượng ta s ẽ được kh ối lượng c ủa lượng d ầ u Quá trình thự c hi ện phân tích lượ ng d ầ u diesel cịn l ạ i trong d ịch l ỏng được ti ế n hành t ạ i Vi ệ n Hóa Cơng Nghi ệ p
2 2 4 Xử lý thống kê
Các kết quả, số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học Dựa vào phần mềm Excel để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tính trung bình mẫu Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là p<0,05
Địa điểm nghiên cứu: Phịng CNSH mơi trường, Viện Cơng nghệ sinh học,
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3 1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ
3 1 1 Kết quả phân lập VKTQH từ các mẫu nước và bùn ô nhiễm dầu
Để phân lập các chủng VKTQH tiềm năng có khả năng phân huỷ
hydrocarbon dầu mỏ, các mẫu nước và bùn đã được thu thập tại các vùng biển Việt Nam Các mẫu được làm giàu trong mơi trường DSMZ 27 có bổ sung dầu diesel hoặc naphthalene, pyrene và anthracene Sau đó, các bình ni VK được giữ trong điều kiện kỵ khí, ánh sáng tương đương 5000 Lux, nhiệt độ 30±2oC (Hình 3 1)
Theo dõi sau 5 - 7 ngày, màu sắc của môi trường làm giàu chuyển đổi rõ rệt sang màu đỏ tía, trên thành bình cũng quan sát có xuất hiện của các vệt màu Kết quả này cho thấy có sự biểu hiện của VKTQH, thể hiện ở sắc tố quang hợp đặc trưng Như vậy, dịch huyền phù trên các bình làm giàu được thu lại để tiến hành thí nghiệm phân lập các chủng VKTQH
Trước Sau
zau
Tiếp theo, các dịch làm giàu đã pha lỗng được cấy trên mơi trường thạch DSMZ 27 có bổ sung hydrocarbon dầu mỏ (toluene/pyrene/naphthalene/dầu diesel/ phenol/anthracene), tổng số 15 khuẩn lạc VKTQH đã bước đầu được tách riêng, làm thuần trên các mơi trường thạch (Hình 3 2, Bảng 3 1) Trong đó, Hình 3 2 minh họa sự phát triển khuẩn lạc của chủng VKTQH được làm giàu từ mẫu nước bị ô nhiễm dầu mỏ, trong khi Bảng 3 1 mô tả hình thái các khuẩn lạc VKTQH đã phân lập trong luận án này
Hình 3 2 Một số khuẩn lạc VKTQH được phân lập từ mẫu làm giàu
Kết quả từ Bảng 3 1 cho thấy tại 15 khuẩn lạc VKTQH phân lập được tại vị trí ơ nhiễm khác nhau có màu sắc, kích thước và hình dáng khuẩn lạc khác nhau và rất đa dạng Màu sắc khuẩn lạc của chúng chủ yếu là từ đỏ nhạt đỏ tía đến đỏ đậm, từ nâu nhạt đến nâu đậm, vàng nhạt đến vàng đậm Tại vùng biển Quảng Ngãi phân lập được nhiều chủng vi khuẩn nhất (8 chủng), vùng biển Vũng Tàu phân lập được ít chủng vi khuẩn nhất (2 chủng), Nha Trang - Khánh Hòa lập được 5 chủng (Cảng cầu đá 3 chủng và Làng chài 2 chủng) Trên nguồn cơ chất toluene phân lập được nhiều chủng nhất (4 chủng); tiếp theo trên pyrene phân lập được 3 chủng; trên napthalene, dầu diesel, phenol, anthracene mỗi nguồn cơ chất phân lập được 2 chủng Toàn bộ 15 chủng VKTQH đã phân lập được tiếp tục được lưu giữ trong glycerol 20% ở điều kiện -20oC để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo
Bảng 3 1 Kết quả phân lập các khuẩn lạc VKTQH từ nguồn mẫu nước bị ô nhiễm dầu mỏ ở các vùng biển Việt Nam STT Ký hiệu
khuẩn lạc
Hình ảnh khuẩn lạc Hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc Nguồn cơ chất Nguồn phân lập 1 DQ41 (DD4)
Khuẩn lạc trịn, lồi, bóng, có rìa trong, khơng nhân, màu đỏ đậm, đường kính 1 - 1,5mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
2 DQ42 loang, màu tím tía, đường kínhKhuẩn lạc trịn, lồi, rìa trong, 1mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
3 DQ51 Khuẩn lạc trịn, trơn, bóng, có rìaphẳng, màu đỏ tía, đường kính 0,5 mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
4 DQ52 trong, màu đỏ tía, đường kính <Khuẩn lạc trịn, trơn, bóng, có rìa 0 5mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
5 DQ81 trong và phẳng, có nhân, màu đỏKhuẩn lạc trịn, lồi, nhẵn bóng, rìa đậm, đường kính 2 - 2,5 mm
Napthalene Mẫu nước nhiễm dầu tạivùng biển Quãng Ngãi
6 DQ82 có chân, màu đỏ gạch, đường kínhKhuẩn lạc trịn, lồi, bóng, có nhân, 1,5 mm
Napthalene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
7 FO1 Khuẩn lạc trịn, lồi, trơn, bóng, rìa
loang, đỏ tía, đường kính 1 mm
Dầu diesel Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Vũng Tàu
8 FO2 Khuẩn lạc trịn, trơn, rìa loang, đỏ
nhạt, đường kính < 0,5 mm
Dầu diesel Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Vũng Tàu
STT Ký hiệu khuẩn lạc
Hình ảnh khuẩn lạc Hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc
Nguồn cơ chất
Nguồn phân lập
9 DD3 Khuẩn lạc trịn, bóng, rìa trong, có
nhân, đỏ nhạt, đường kính 1 mm
Phenol Mẫu bùn nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
10 DD4 Khuẩn lạc tròn, nhỏ li ti, màu đỏ
nhạt
Phenol Mẫu bùn nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
11 PY2 Khuẩn lạc có nhân, lồi, trịn, bềmặt bóng, màu nâu vàng, đường kính 0 8-1 2 mm
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hòa
12 PY6 hơn, mép loang, màu nâu vàng,Khuẩn lạc có nhân màu nâu đậm đường kính 1 5 mm
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hòa
13 PY9 nhân, rìa trong, đường kính 1-2Khuẩn lạc màu hồng nhạt, có mm
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hịa
14 LC1 màu đỏ nhạt, rìa trong, đườngKhuẩn lạc trịn, lồi, trơn, bóng, kính 2-2 5 mm
Anthracene Làng chài Nha Trang – Khánh Hịa
15 LC5 màu đỏ, nhớt, có rìa, đường kính 5Khuẩn lạc hồng nhạt, có nhân mm
Anthracene Làng chài Nha Trang – Khánh Hòa
3 1 2 Tuyển chọn các chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ
3 1 2 1 Đánh giá khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Các chủng VKTQH sau khi được phân lập và làm sạch cùng 17 chủng VKTQH trong bộ sưu tập được tuyển chọn theo phương pháp 2 2 1 4 chương 2 được nuôi trong môi trường DSMZ 27 để đánh giá khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học Bảng 3 2 trình bày kết quả xác định khả năng sinh trưởng của 32 chủng VKTQH phân lập được sau 7 ngày nuôi cấy:
Bảng 3 2 Khả năng sinh trưởng của các chủng VKTQH
STT Ký hiệu chủng ∆OD800 1 FO2 1 291±0 01 2 DQ52 1 283±0 012 3 DQ41 (DD4) 1 257±0 01 4 DQ42 1 25±0 02 5 DD3 1 228±0 03 6 DD4 1 222±0 01 7 DQ51 1 21±0 02 8 DQ82 1 19±0 012 9 FO1 1 163±0 01 10 DQ81 1 162±0 018 11 DG211 0 99±0 06 12 QP21 0 99±0 02 13 DG217 0 98±0 01 14 DG114 0 97±0 038 15 DG12 0 97±0 024
Kết quả cho thấy, tất cả 32 chủng VKTQH đều sinh trưởng tốt trên mơi trường DSMZ 27, trong đó có 10 chủng có kí hiệu là FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 sinh trưởng tốt nhất (∆OD800>1)
Song song với thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng của 32 chủng VKTQH chúng tơi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng tạo màng sinh học
STT Ký hiệu chủng ∆OD800 16 PY6 0 97±0 023 17 LACM2I2 0 96±0 01 18 NMS412 0 95±0 023 19 A3II3 0 94±0 026 20 PY2 0 93±0 03 21 DG218 0 91±0 05 22 LC1 0 90±0 01 23 MI1 0 87±0 04 24 DG213 0 84±0 018 25 NMS25 0 82±0 02 26 VH 0 82±0 01 27 LC5 0 78±0 03 28 DG214 0 77±0 011 29 NMS411 0 76±0 01 30 PY9 0 74±0 01 31 HQP304 0 73±0 03 32 LACM1 0 71±0 01
Hình 3 3 Khả năng tạo màng sinh học dựa trên khả năng bắt giữ tím tinh thể của
màng sinh học do các chủng VKTQH tạo thành
Hình 3 4 Khả năng tạo màng sinh học của các chủng VKTQH phân hủy
hydrocarbon dầu mỏ và Acinetobacter calcoaceticus P23 (K: đối chứng âm) Kết quả tạo màng sinh học của 32 chủng VKTQH được so sánh với chủng chủng P23 là đối chứng dương [124] cho thấy 10 chủng là FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 tạo màng sinh học tốt hơn so với chủng P23 là đối chứng dương có giá trị OD600 đạt 17,6 (Hình 3 3 và 3 4) Trong đó, bốn chủng VKTQH, bao gồm DQ41, DQ51, DD4 và DQ82 có khả năng hình thành màng sinh học mạnh, giá trị OD600 từ 20,6 đến 22,4 và tiếp tục tăng sau 7 ngày ni cấy (Hình 3 3 và Hình 3 4) Do đó, chúng tơi lựa chọn 10 chủng này để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo
3 1 2 2 Khả năng sử dụng hydrocarbon dầu mỏ của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng trên các nguồn hydrocarbon dầu mỏ của 10 chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học tốt Cụ thể, thí nghiệm
được thực hiện bằng cách thay thế acetate trong thành phần của môi trường DSMZ 27 bằng các cơ chất khác nhau, bao gồm dầu diesel, toluene, naphthalene, phenol và pyrene
(i) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên dầu diesel
Kết quả cho thấy cả 10 chủng VKTQH đều ghi nhận có khả năng sinh trưởng tốt trong mơi trường có bổ sung cơ chất dầu diesel nồng độ 4 – 8% (Hình 3 5, Hình 3 6), đáng chú ý nhất là 3 chủng DQ41, FO2 và DD4
Hình 3 5 Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các
nồng độ dầu diesel khác nhau
Hình 3 6 Dịch ni cấy của 10 chủng VKTQH ở 10 % dầu diesel sau 7 ngày
Cụ thể, dựa vào màu sắc dịch huyền phù và đo độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 800 nm, các chủng VKTQH đã được lựa chọn đều có khả năng sinh trưởng trên mơi trường chứa dầu diesel với nồng độ từ 4 - 10% (v/v), tốt nhất trong khoảng 4 - 8% (v/v), chậm sinh trưởng ở nồng độ dầu 9 ÷ 10%
(ii) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên toluene
Toluene là một thành viên trong nhóm chất BTEX (gồm benzene, toluene, ethylbenzene và xylene), là nhóm chất ơ nhiễm phổ biến trong các khí thải cơng nghiệp, nước thải của các nhà máy keo, dung môi, thuốc nhuộm [57] Khả năng sử dụng toluene cũng được xem là một trong những tiêu chí quan trọng khi nghiên cứu về đặc tính của 10 chủng VKTQH trong luận án này
Dựa vào độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào nuôi trong mơi trường có bổ sung toluene ở các nồng độ khác nhau trong 7 ngày đo ở bước sóng 800 nm (Hình 3 7) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3 8), chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 150 ppm chủng FO2 và DQ52 phát triển mạnh nhất (∆OD800 > 1), ở nồng độ 200 ppm chủng DQ41, DD4, DQ52 và FO2 sinh trưởng mạnh (∆OD800 > 1), ở nồng độ 250 ppm chủng DQ41, FO2 và DD4 sinh trưởng mạnh (∆OD800 > 1), đến nồng độ 300 ppm OD sinh trưởng của cả 10 chủng đều bị giảm, đặc biệt là 3 chủng DQ52, DQ81 và DD82 (∆OD800 < 0,8) Ba chủng DQ41, FO2 và DD4 vẫn có thể sinh trưởng khá tốt (0 9 <∆OD800 <1,0)
Hình 3 7 Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ toluene khác
nhau sau 7 ngày ni cấy
Trên thực tế, mức độ gây độc của toluene trong môi trường nước được chỉ ra là ≥ 50 ppm [136], như vậy nồng độ toluene 200 ppm là nồng độ cao, ức chế nhiều loài sinh vật Do đó, 4 chủng DQ41, DD4, DQ52 và FO2 được chúng tơi lựa chọn là các chủng có khả năng sinh trưởng tốt trên toluene
(iii) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên phenol
10 chủng VKTQH đã được ni cấy trong mơi trường DSMZ 27 có bổ sung phenol với các nồng độ 150, 200, 250 và 300 ppm làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất Sau 7 ngày nuôi cấy, khả năng sinh trưởng của các chủng được thể hiện ở Hình 3 9 và Hình 3 10
Hình 3 9 Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các
nồng độ phenol khác nhau
Hình 3 10 Dịch ni cấy của 10 chủng VKTQH ở 150 ppm phenol sau 7 ngày
Dựa vào độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 800 nm màu sắc dịch huyền phù (Hình 3 9) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3 10) chúng tôi nhận thấy, ở nồng độ 150 ppm, hầu hết các chủng VKTQH đều có khả năng sinh
trưởng Tuy nhiên, ở nồng độ 300 ppm, chỉ có ba chủng DQ41, FO2 và DD4 có khả năng sinh trưởng tốt
(iv) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên naphthalene
Naphthalene là hợp chất PAH có độ tan khá cao trong nước nên sự có mặt của naphthalene trong nước gây độc rất lớn cho quần thể sinh vật Cũng như các PAH khác, naphthalene khó bị phân hủy trong tự nhiên Để đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng VKTQH với nguồn carbon là naphthalene, 10 chủng VKTQH đã được nuôi cấy trong môi trường khống có bổ sung naphthalene làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất với nồng độ cơ chất ban đầu là 100, 150, 200 và 250 ppm Sau 7 ngày ni, kết quả được thể hiện trong Hình 3 11 và 3 12
Hình 3 11 Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ naphthalene
khác nhau sau 7 ngày ni cấy
Hình 3 12 Dịch ni cấy của 10 chủng VKTQH ở 200 ppm naphthalene sau 7 ngày
Dựa vào màu sắc dịch huyền phù (Hình 3 11) và độ hấp phụ quang học ở bước sóng 800 nm (Hình 3 12), chúng tơi nhận thấy các chủng đều có khả năng sinh
trưởng tốt ở nồng độ naphthalene từ 100 ppm đến 200 ppm Tuy nhiên, với nồng độ 250 ppm, chỉ có 3 chủng DQ52, DQ81 và DD4 là có khả năng sinh trưởng tốt trong đó chủng DD4 có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh nhất mật độ tế bào trung bình > 1 chủng DQ52 và DQ81 sinh trưởng tốt, chủng FO1 sinh trưởng kém nhất
(v) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên pyrene
Pyrene có cấu tạo 4 vịng thơm, ít tan trong nước, tan tốt trong dung môi hữu cơ Pyrene là hợp chất khó phân hủy nhất trong số 4 loại hydrocarbon thơm mà chúng tôi đã lựa chọn sử dụng trong nghiên cứu Do đó, 10 chủng VKTQH đã được đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển trên nguồn carbon là pyrene với nồng độ ban đầu là 100, 150, 200 và 250 ppm Kết quả sau 7 ngày ni cấy được thể hiện ở Hình 3 13 và 3 14
Hình 3 13 Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các
nồng độ pyrene khác nhau
Dựa vào độ hấp phụ quang học ở bước sóng 800 nm (Hình 3 13) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3 14), chúng tơi nhận thấy trong 10 chủng vi khuẩn thì có 9 chủng phát triển tốt, trong đó có 3 chủng DQ41, FO2 và DD4 có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh nhất mật, ∆OD800 > 1
Như vậy, các thí nghiệm đánh giá khả năng sử dụng dầu diesel, naphthalene, phenol, pyrene và toluene của 10 chủng VKTQH được tổng hợp ở Bảng 3 3
Bảng 3 3 Khả năng sinh trưởng trên các nguồn cơ chất hydrocarbon của các
chủng VKTQH
Chú thích: sinh trưởng tốt ∆OD800>1, các tên in đậm là các chủng được lựa chọn