Các kết quả, số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học. Dựa vào phần mềm Excel để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tính trung bình mẫu. Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là p<0,05.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng CNSH môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ
3.1.1. Kết quả phân lập VKTQH từ các mẫu nước và bùn ô nhiễm dầu
Để phân lập các chủng VKTQH tiềm năng có khả năng phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ, các mẫu nước và bùn đã được thu thập tại các vùng biển Việt Nam. Các mẫu được làm giàu trong môi trường DSMZ 27 có bổ sung dầu diesel hoặc naphthalene, pyrene và anthracene. Sau đó, các bình nuôi VK được giữ trong điều kiện kỵ khí, ánh sáng tương đương 5000 Lux, nhiệt độ 30±2oC (Hình 3.1).
Theo dõi sau 5 - 7 ngày, màu sắc của môi trường làm giàu chuyển đổi rõ rệt sang màu đỏ tía, trên thành bình cũng quan sát có xuất hiện của các vệt màu. Kết quả này cho thấy có sự biểu hiện của VKTQH, thể hiện ở sắc tố quang hợp đặc trưng. Như vậy, dịch huyền phù trên các bình làm giàu được thu lại để tiến hành thí nghiệm phân lập các chủng VKTQH.
Trước Sau
Hình 3.1. Mẫu bùn ô nhiễm dầu trước và sau làm giàu
45
Tiếp theo, các dịch làm giàu đã pha loãng được cấy trên môi trường thạch DSMZ 27 có bổ sung hydrocarbon dầu mỏ (toluene/pyrene/naphthalene/dầu diesel/ phenol/anthracene), tổng số 15 khuẩn lạc VKTQH đã bước đầu được tách riêng, làm thuần trên các môi trường thạch (Hình 3.2, Bảng 3.1). Trong đó, Hình 3.2 minh họa sự phát triển khuẩn lạc của chủng VKTQH được làm giàu từ mẫu nước bị ô nhiễm dầu mỏ, trong khi Bảng 3.1 mô tả hình thái các khuẩn lạc VKTQH đã phân lập trong luận án này.
Hình 3.2. Một số khuẩn lạc VKTQH được phân lập từ mẫu làm giàu
Kết quả từ Bảng 3.1 cho thấy tại 15 khuẩn lạc VKTQH phân lập được tại vị trí ô nhiễm khác nhau có màu sắc, kích thước và hình dáng khuẩn lạc khác nhau và rất đa dạng. Màu sắc khuẩn lạc của chúng chủ yếu là từ đỏ nhạt đỏ tía đến đỏ đậm, từ nâu nhạt đến nâu đậm, vàng nhạt đến vàng đậm. Tại vùng biển Quảng Ngãi phân lập được nhiều chủng vi khuẩn nhất (8 chủng), vùng biển Vũng Tàu phân lập được ít chủng vi khuẩn nhất (2 chủng), Nha Trang - Khánh Hòa lập được 5 chủng (Cảng cầu đá 3 chủng và Làng chài 2 chủng). Trên nguồn cơ chất toluene phân lập được nhiều chủng nhất (4 chủng); tiếp theo trên pyrene phân lập được 3 chủng; trên napthalene, dầu diesel, phenol, anthracene mỗi nguồn cơ chất phân lập được 2 chủng. Toàn bộ 15
chủng VKTQH đã phân lập được tiếp tục được lưu giữ trong glycerol 20% ở điều kiện -20oC để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập các khuẩn lạc VKTQH từ nguồn mẫu nước bị ô nhiễm dầu mỏ ở các vùng biển Việt Nam STT Ký hiệu Hình ảnh khuẩn lạc khuẩn lạc DQ41 1. (DD4) 2. DQ42 3. DQ51 4. DQ52 5. DQ81 6. DQ82 7. FO1 8. FO2
STT Ký hiệu Hình ảnh khuẩn lạc khuẩn lạc 9. DD3 10. DD4 11. PY2 12. PY6 13. PY9 14. LC1 15. LC5
3.1.2. Tuyển chọn các chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ
3.1.2.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Các chủng VKTQH sau khi được phân lập và làm sạch cùng 17 chủng VKTQH trong bộ sưu tập được tuyển chọn theo phương pháp 2.2.1.4 chương 2 được nuôi trong môi trường DSMZ 27 để đánh giá khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học. Bảng 3.2 trình bày kết quả xác định khả năng sinh trưởng của 32 chủng VKTQH phân lập được sau 7 ngày nuôi cấy:
Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng của các chủng VKTQH
STT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. download by : skknchat@gmail.com
Kết quả cho thấy, tất cả 32 chủng VKTQH đều sinh trưởng tốt trên môi trường DSMZ 27, trong đó có 10 chủng có kí hiệu là FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 sinh trưởng tốt nhất (∆OD800>1).
Song song với thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng của 32 chủng VKTQH chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng tạo màng sinh học.
Hình 3.3. Khả năng tạo màng sinh học dựa trên khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do các chủng VKTQH tạo thành
Hình 3.4. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng VKTQH phân hủy
hydrocarbon dầu mỏ và Acinetobacter calcoaceticus P23 (K: đối chứng âm)
Kết quả tạo màng sinh học của 32 chủng VKTQH được so sánh với chủng chủng P23 là đối chứng dương [124] cho thấy 10 chủng là FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 tạo màng sinh học tốt hơn so với chủng P23 là đối chứng dương có giá trị OD600 đạt 17,6 (Hình 3.3 và 3.4). Trong đó, bốn chủng VKTQH, bao gồm DQ41, DQ51, DD4 và DQ82 có khả năng hình thành màng sinh học mạnh, giá trị OD600 từ 20,6 đến 22,4 và tiếp tục tăng sau 7 ngày nuôi cấy (Hình 3.3 và Hình 3.4). Do đó, chúng tôi lựa chọn 10 chủng này để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.2. Khả năng sử dụng hydrocarbon dầu mỏ của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng trên các nguồn hydrocarbon dầu mỏ của 10 chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học tốt. Cụ thể, thí nghiệm
51
được thực hiện bằng cách thay thế acetate trong thành phần của môi trường DSMZ 27 bằng các cơ chất khác nhau, bao gồm dầu diesel, toluene, naphthalene, phenol và pyrene.
(i) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên dầu diesel
Kết quả cho thấy cả 10 chủng VKTQH đều ghi nhận có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có bổ sung cơ chất dầu diesel nồng độ 4 – 8% (Hình 3.5, Hình 3.6), đáng chú ý nhất là 3 chủng DQ41, FO2 và DD4.
Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ dầu diesel khác nhau
Hình 3.6. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 10 % dầu diesel sau 7 ngày Cụ thể, dựa vào màu sắc dịch huyền phù và đo độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 800 nm, các chủng VKTQH đã được lựa chọn đều có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa dầu diesel với nồng độ từ 4 - 10% (v/v), tốt nhất trong khoảng 4 - 8% (v/v), chậm sinh trưởng ở nồng độ dầu 9 ÷ 10%.
(ii) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên toluene
Toluene là một thành viên trong nhóm chất BTEX (gồm benzene, toluene, ethylbenzene và xylene), là nhóm chất ô nhiễm phổ biến trong các khí thải công nghiệp, nước thải của các nhà máy keo, dung môi, thuốc nhuộm [57]. Khả năng sử dụng toluene cũng được xem là một trong những tiêu chí quan trọng khi nghiên cứu về đặc tính của 10 chủng VKTQH trong luận án này.
Dựa vào độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào nuôi trong môi trường có bổ sung toluene ở các nồng độ khác nhau trong 7 ngày đo ở bước sóng 800 nm (Hình 3.7) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.8), chúng tôi nhận thấy ở nồng độ
150 ppm chủng FO2 và DQ52 phát triển mạnh nhất (∆OD800 > 1), ở nồng độ 200 ppm chủng DQ41, DD4, DQ52 và FO2 sinh trưởng mạnh (∆OD800 > 1), ở nồng độ
250 ppm chủng DQ41, FO2 và DD4 sinh trưởng mạnh (∆OD800 > 1), đến nồng độ
300 ppm OD sinh trưởng của cả 10 chủng đều bị giảm, đặc biệt là 3 chủng DQ52, DQ81 và DD82 (∆OD800 < 0,8). Ba chủng DQ41, FO2 và DD4 vẫn có thể sinh trưởng khá tốt (0.9 <∆OD800 <1,0).
Hình 3.7. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ toluene khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy
Hình 3.8. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 250 ppm toluene sau 7 ngày
53
Trên thực tế, mức độ gây độc của toluene trong môi trường nước được chỉ ra là ≥ 50 ppm [136], như vậy nồng độ toluene 200 ppm là nồng độ cao, ức chế nhiều loài sinh vật. Do đó, 4 chủng DQ41, DD4, DQ52 và FO2 được chúng tôi lựa chọn là các chủng có khả năng sinh trưởng tốt trên toluene.
(iii) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên phenol
10 chủng VKTQH đã được nuôi cấy trong môi trường DSMZ 27 có bổ sung phenol với các nồng độ 150, 200, 250 và 300 ppm làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Sau 7 ngày nuôi cấy, khả năng sinh trưởng của các chủng được thể hiện ở Hình 3.9 và Hình 3.10.
Hình 3.9. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ phenol khác nhau
Hình 3.10. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 150 ppm phenol sau 7 ngày Dựa vào độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 800 nm màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.9) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.10) chúng tôi nhận thấy, ở nồng độ 150 ppm, hầu hết các chủng VKTQH đều có khả năng sinh
trưởng. Tuy nhiên, ở nồng độ 300 ppm, chỉ có ba chủng DQ41, FO2 và DD4 có khả năng sinh trưởng tốt.
(iv) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên naphthalene
Naphthalene là hợp chất PAH có độ tan khá cao trong nước nên sự có mặt của naphthalene trong nước gây độc rất lớn cho quần thể sinh vật. Cũng như các PAH khác, naphthalene khó bị phân hủy trong tự nhiên. Để đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng VKTQH với nguồn carbon là naphthalene, 10 chủng VKTQH đã được nuôi cấy trong môi trường khoáng có bổ sung naphthalene làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất với nồng độ cơ chất ban đầu là 100, 150, 200 và 250 ppm. Sau 7 ngày nuôi, kết quả được thể hiện trong Hình 3.11 và 3.12.
Hình 3.11. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ naphthalene khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy
Hình 3.12. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 200 ppm naphthalene sau 7 ngày Dựa vào màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.11) và độ hấp phụ quang học ở bước sóng 800 nm (Hình 3.12), chúng tôi nhận thấy các chủng đều có khả năng sinh
55
trưởng tốt ở nồng độ naphthalene từ 100 ppm đến 200 ppm. Tuy nhiên, với nồng độ 250 ppm, chỉ có 3 chủng DQ52, DQ81 và DD4 là có khả năng sinh trưởng tốt trong đó chủng DD4 có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh nhất mật độ tế bào trung bình > 1 chủng DQ52 và DQ81 sinh trưởng tốt, chủng FO1 sinh trưởng kém nhất.
(v) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên pyrene
Pyrene có cấu tạo 4 vòng thơm, ít tan trong nước, tan tốt trong dung môi hữu cơ. Pyrene là hợp chất khó phân hủy nhất trong số 4 loại hydrocarbon thơm mà chúng tôi đã lựa chọn sử dụng trong nghiên cứu. Do đó, 10 chủng VKTQH đã được đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển trên nguồn carbon là pyrene với nồng độ ban đầu là 100, 150, 200 và 250 ppm. Kết quả sau 7 ngày nuôi cấy được thể hiện
ở Hình 3.13 và 3.14.
Hình 3.13. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ pyrene khác nhau
Hình 3.14. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 200 ppm pyrene sau 7 ngày
Dựa vào độ hấp phụ quang học ở bước sóng 800 nm (Hình 3.13) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.14), chúng tôi nhận thấy trong 10 chủng vi khuẩn thì có 9 chủng phát triển tốt, trong đó có 3 chủng DQ41, FO2 và DD4 có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh nhất mật, ∆OD800 > 1.
Như vậy, các thí nghiệm đánh giá khả năng sử dụng dầu diesel, naphthalene, phenol, pyrene và toluene của 10 chủng VKTQH được tổng hợp ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng trên các nguồn cơ chất hydrocarbon của các chủng VKTQH Nguồn cơ chất Toluene Phenol Naphthalene Pyrene Dầu diesel
Chú thích: sinh trưởng tốt ∆OD800>1, các tên in đậm là các chủng được lựa chọn.
Ba chủng DQ41, DD4, FO2 được lựa chọn là các chủng VKTQH đồng thời sở hữu hai đặc tính quý là tạo màng sinh học và khả năng sử dụng các hydrocarbon dầu mỏ.
3.2. Các đặc điểm sinh học và định danh ba chủng DQ41, DD4 và FO2
3.2.1. Các đặc điểm hình thái
Để xác định đặc điểm hình thái, ba chủng DQ41, DD4, FO2 được nuôi cấy trong môi trường DSMZ 27 bổ sung 2% thạch, ở điều kiện kỵ khí – sáng, cường độ chiếu sáng khoảng 5.000 lux, nhiệt độ 30±2 oC. Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử được tiến hành khi chúng đang ở giữa pha sinh trưởng (pha log). Sau
5 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành quan sát hình dạng, kích thước của khuẩn lạc trên kính hiển vi quang học, nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (Hình 3.15).
Kết quả nhuộm Gram cho thấy cả ba chủng VKTQH đều là VK Gram (-).
A B
C
E
D
F
Hình 3.15. Hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào dưới kính hiển vi điện tử của chủng DD4, DQ41, FO2
Hình thái chủng DD4: Các khuẩn lạc của chủng DD4 có hình tròn, nhỏ li ti, có màu đỏ nhạt (Hình 3.15A). Tế bào của chúng có dạng hình que, xoắn, bề mặt nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 700 x 2210 nm (Hình 3.15B).
Hình thái chủng DQ41: Các khuẩn lạc của chủng DQ41 cũng có hình tròn, lồi, bóng, không nhân, có rìa trong, màu đỏ đậm, đường kính 1 - 1.5 mm (Hình 3.15C). Tế bào của chúng có dạng hình que, bề mặt nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 540 x 1320 nm (Hình 3.15D).
58
Hình thái chủng FO2: Các khuẩn lạc của chủng FO2 có hình tròn, nhẵn, nhỏ và màu đỏ nhạt và được bao phủ bởi một viền mờ đục, đường kính nhỏ hơn 0.5
am (Hình 3.15E). Tế bào của chúng có dạng hình que, bề mặt hơi nhăn, đơn bào, kích thước khoảng 515 x 1160 nm (Hình 3.15F).
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy tất cả các chủng này đều có dạng hình gậy, với kích thước 500 ×1100 ÷ 700 ×2200 nm. Đáng chú ý, chủng FO2 có phương thức sinh sản là nảy chồi (Hình 3.15F).
3.2.2. Trình tự 16S rRNA và định danh ba chủng DQ41, DD4 và FO2
Để định danh các chủng VKTQH phân lập được, trình tự vùng gen mã hóa 16S rRNA được đọc và so sánh với ngân hàng dữ liệu [125].
Trình tự gần đủ của các đoạn gen 16S rRNA của 3 chủng FO2, DQ41, DD4 ῀1500 bp đã được xác định và so sánh với trình tự 16S rDNA trên cơ sở dữ liệu trên GenBank và xây dựng cây phát sinh chủng loại (Hình 3.16).
Hình 3.16. Cây phát sinh chủng loại của 3 chủng DD4, DQ41, FO2
Cả ba chủng VKTQH DD4, DQ41và FO2 đều có trình tự gen mã hóa 16S rRNA có mức độ tương đồng cao nhất đối với R. palustris (> 99%) và mức độ tương đồng này thấp hơn so với R. faecalis (> 98%).
Dựa trên các đặc điểm hình thái và trình tự của gen mã hóa 16S rRNA, ba chủng được chọn được đặt tên là Rhodopseudomonas sp. DD4, Rhodopseudomonas
sp. DQ41 và Rhodopseudomonas sp. FO2. Trình tự gen 16S rRNA của 3 chủng FO2, DQ41, DD4 đã được đăng ký trong GenBank với mã số tương ứng là LC318127, LC318128 và LC318129.
Liên quan đến phân hủy hydrocarbon trong điều kiện kỵ khí, một loài thuộc
chi Rhodopseudomonas đã được phân lập từ vùng bị ô nhiễm. Chủng R. palustris
RP2 đã được phân lập từ lớp màng sinh học tạo ra từ các VSV phân hủy hydrocarbon, có khả năng khử được các oxit kim loại, khử nitrate trong điều kiện kỵ khí, đặc biệt có khả năng phân hủy được thành phần n-alkane của hydrocarbon dầu