C.2.1 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử nghiệm C.2.1.1 Lấy mẫu
Theo tiêu chuẩn lấy mẫu kiểm nghiệm, một mẫu đem thử phảI làm ít nhất trên 03 đơn vị đóng gói nhỏ nhất.
C.2.1.2 Pha chế mẫu thử nghiệm.
Tuỳ theo từng sản phẩm, lấy một lượng sản phẩm đại diện từ các đơn vị đóng gói (khoảng từ 10-50 g hoặc 10-50 ml sản phẩm) vào bình nón, thêm dung môi pha loãng thích hợp để pha loãng sản phẩm thành các nồng độ đem thử nghiệm thích hợp như: 10-1, 10-2, 10-3 hoặc 1/2; 1/5 ; 1/20 ; 1/40 v. v. . . sao cho khi đếm khuẩn lạc trên đĩa Petri có đường kính 90-100 mm, số lượng khuẩn lạc không vượt quá 300 trong một đĩa.
C.2.2 Dụng cụ và phương tiện thử nghiệm
Thử nghiệm được tiến hành trong các đIều kiện vô trùng, đảm bảo không có sự lây nhiễm các vi khuẩn từ ngoàI vào mẫu thử. Các phương tiện và dụng cụ cần dùng gồm:
- Pipet chia vạch có thể tích 1; 5 và 10 ml. - Bình nón dung tích 100; 250 và 500 ml
- Ống nghiệm các loại 16-160 mm; 18-200 mm
- Nồi cách thuỷ ổn định được nhiệt độ trong khoảng 35-45 0 C - Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 32 0 C ± 1 0 C - Tủ sấy - Nồi hấp tiệt trùng - Máy đo pH C.2.3 Hoá chất - Thạch dùng cho vi sinh vật
- Pepton dùng cho vi sinh vật
- Natri clorid tinh khiết (Na Cl) - Glucose tinh khiết
- Dinatri hydrophotsphat tinh khiết
- Natri dihydrophotsphat
- Kali Dihydrophotsphat tinh khiết
- Dikali hydrophotsphat tinh khiết - Acid lactic: dung dịch 20 % hoặc 30 %
- Acid citric : dung dịch 20 %
- Natri hydroxit tinh khiết (NaOH)
- Dung dịch natri hydroxit 0,1 N
- N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid
- Magnesi clorid
- Cetrimid (Cetyl trimethyl amoni bromid) - Magnesi sulfat ngậm nước
- Glycerin - Tween 80 - Đỏ trung tính - Tím tinh thể - Xanh Brilliant C.2.4 Môi trường
C.2.4.1 Các môi trường dùng để pha loãng, đếm các vi khuẩn, nấm mốc
C.2.4.1.1 Nước Pepton
Pepton 1 g Natri clorid 8,5 g
Nước cất 1000 ml C.2.4.1.2 Nước muối sinh lý
Natri clorid 8, 5 g Nước cất 1000 ml
C.2.4.1.3 Môi trường thạch Saboruaud
Pepton 10 g
Glucose 40 g Thạch 15-20 g Nước cất 1000 ml
pH sau khi tiệt trùng: 5,6 6 0,2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách pha: Hoà tan các chất trong nước, đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan hoàn toàn. Đóng vào các bình dung tích 250 ml, mỗi bình 150 ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp 1100 C trong thời gian 15-20 phút. Môi trường có thể bảo quản ở 40 C và sử dụng trong vòng 30 ngày.
C.2.4.1.4 Môi trường thạch thường
Pepton 10 g
Natri clorid 5 g
Thạch 15-20 g Nước cất 1000 ml
pH sau khi hấp tiệt trùng 7,4 -7,6
C.2.4.2.1 . Môi trường thạch Cetrimid Gelatin pancreatic 20,0 g Magnegi clorid 1,4 g Glycerin 10,0 ml Cetrimid 0,3 g Thạch 13,6 g Nước cất 1000 ml
Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều; đun sôI 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng 7,2 ± 0,2.
C.2.4.2.2 Môi trường thạch để phát hiện Fluorescin của Pseudomonas
Casein pancreatic 10,0 g
Pepton 10,0 g Dikali hydrophotsphat khan 1,5 g Magnesi sulfat ngậm nước 1,5 g
Thạch 15,0 g
Glycerin 10,0 g
Nước cất 1000 ml.
Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều; đun sôI 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng 7,2 ± 0,2.
C.2.4.2.3. Môi trường thạch để phát hiện Pyocyanin của Pseudomonas Gelatin pancreatic 20,0 g
Magnesi clorid khan 1,4 g
Kali sunfat khan 10,0 g Thạch 15,0 g
Glycerin 10,0 ml Nước cất 1000 ml.
Cách pha: Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôI 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng là 7,2 ± 0,2.
C.2.4.2.4 Môi trường RAT.
Bột gạo 15,0 g
Tween 80 10 ml Thạch 13,5 g Nước cất 1000 ml
pH sau khi tiệt trùng 4,5 -5,5
C.2.4.2.5 MôI trường thạch muối mật có lactose và glucose, chỉ thị tím tinh thể, đỏ trung tính.
Cao men bia 3,9 g Gelatin pancreatic 7,0 g
Muối mật 1,5 g Lactose 10,0 g Natri clorid 5,0 g D-glucose monohydrat 10,0 g Thạch 15,0 g Đỏ trung tính 30 mg Tím tinh thể 2 mg Nước cất 1000 ml
Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,4 ± 0,2. Đun tới sôi nhưng không đun trong nồi hấp.
C.2.4.2.6 Canh thang làm giầu Enterobacteriacease - Mossel (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gelatin pancreatic: 10g D-glucose monohydrat 5,0g Mật bò khô: 20,0g Kali dihydrophosphat: 2,0g Di natri hydrophosphat: 8,0g Xanh Briliant: 15,0mg Nước cất: 1000ml
Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,2 ± 0,2. Đun ở 1000 C trong 30 phút và làm lạnh ngay.
C.2.4.2.7 Môi trường thạch Manitol-muối.
Casein pancreatic 5,0 g Pepton 5,0 g Cao thịt 1,0 g Natri clorid 75,0 g D-manitol 10,0 g Đỏ phenol 25 mg Thạch 15,0 g
Cách pha: Trộn, đun nóng, khuấy đều, sau đó đun sôi 1 phút để hoà tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt trùng: 7,4 ± 0,2
C.2.4.2.7 Môi trường lỏng Casein đậu tương
Casein pancreatic: 0,5 g Bột đậu tương ( thuỷ phân bởi papain): 3,0 g
Natri clorua: 5,0 g Dikali hydrophosphat 2,5 g
Glucosa: 2,5 g Nước cất: 1000 ml
Cách pha: Hoà tan các chất rắn vào nước, đun nóng nhẹ cho tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp, đem tiệt trùng, pH sau khi tiệt trùng 7,3 ± 0,2 .
C.2.5 Tiến hành nuôI cấy, xác định và phân lập
2.5.1 Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc sống lại được
2.5.1.1 Pha loãng sản phẩm: tiến hành theo điều 2.1.2 2.5.1.2 Cấy truyền:
Trước tiên cấy kiểm tra pipet trên một đĩa môi trường phát hiện vi khuẩn và một đĩa môi trường nấm mốc.
Dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi hộp Petri 1 ml sản phẩm đã pha loãng, mỗi độ pha loãng cấy vào 2 hộp để xác định số lượng vi khuẩn hiếu khí sống lại được và 2 hộp để xác định số lượng nấm mốc sống lại được.
C.2.5.1.3 Đổ đĩa
Đun nóng chảy hoàn toàn các loại môi trường dùng để đếm vi khuẩn, nấm mốc, để nguội đến 450C, rót vào các hộp Petri (đã cấy sẵn trong mỗi hộp 1 ml của một độ pha loãng của sản phẩm) mỗi hộp 15 - 20 ml môi trường; trộn đều sản phẩm đã pha loãng với môi trường bằng cách xoay hộp Petri qua phải và qua trái mỗi chiều 2-3 lần. Để đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.
Thường dùng môi trường thạch thường để đếm vi khuẩn hiếu khí
Thường dùng môi trường Sabouraud để đếm nấm mốc C.2.5.1.4 Ủ ấm
Những đĩa thạch dùng để đếm vi khuẩn được ủ ở 32-350C, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa sau khi ủ 48-72 giờ.
Những đĩa thạch dùng để đếm nấm mốc ở 256 20C, đếm khuẩn lạc mọc trên đĩa sau khi ủ từ 3-5 ngày.
C.2.5.1.5 Tính kết quả
Số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc sống lại được có trong 1 g hoặc 1 ml sản phẩm được tính theo công thức sau:
trong đó:
M = Số lượng vi khuẩn, nấm mốc sống lại được có trong 1 g hoặc 1 ml sản phẩm.
C = Tổng số khuẩn lạc đếm được ở các đĩa Petri cùng một độ pha loãng.
n = Số đĩa trong một độ pha loãng d = độ pha loãng
N= Số độ pha loãng (thí dụ đếm hai độ pha loãng 101 và 102 : N =2; đếm ở những độ pha
loãng 2,5 và 10 thì N = 3 v.v...) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.5.2 Phân lập vi khuẩn
2.5.2.1 Tìm Staphylococcus aureus
Cho chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ấm 350C trong khoảng 24-48 giờ. Quan sát môI trường, nếu thấy vi khuẩn mọc, dùng que cấy lấy một quai cấy,
cấy lên một đĩa thạch Mannitol- muối. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, đem ủ ấm ở 350C trong 24 giờ. Sau khi ủ ấm, kiểm tra nếu thấy:
Trên đĩa thạch Mannitol- muối có thấy những khuẩn lạc màu vàng cùng với một vùng mầu vàng xung quanh, dùng que cấy lấy khuẩn lạc đIển hình, đem nhuộm Gram, soi kính thấy tụ cầu khuẩn hình chùm nho, bắt mầu gram dương, đường kính khoảng 0,8 - 1mm; tiếp tục làm các phản ứng sinh vật hoá học của Staphylococcus aureus. Chuyển một lạc khuẩn nghi ngờ đặc trưng vào ống nghiệm nhỏ, sạch vô trùng, thêm vào ống 0,5 ml huyết tương thỏ. Đem ủ ấm cách thuỷ 370C; sau 3 giờ ủ ấm, kiểm tra các ống thử, tiếp tục ủ ấm thêm 24 giờ. Nếu thấy có hiện tượng đông huyết tương ở bất kỳ mức độ nào- sản phẩm có Staphylococcus aureus.
2.5.2.2 Tìm Pseudomonas aeruginosa
Cho chế phẩm vào 100 ml môI trường lỏng casein đậu tương, ủ ấm ở 350C trong 24-48 giờ. Quan sát môi trường, nếu thấy vi khẩn mọc, dùng dùng que cấy lấy một quai cấy, cấy lên một đĩa thạch Cetrimid. đậy đĩa, lật ngược hộp Petri và đem ủ ấm ở 350C trong 24 giờ. sau khi ủ ấm, kiểm tra nếu thấy:
Trên môi trường thạch Cetrimid có khuẩn lạc màu lục nhạt, có ánh huỳnh quang màu lục, thì lấy khuẩn lạc , nhuộm gram và soi kính. Nếu thấy trực khuẩn Gram âm và phản ứng oxydaza dương tính thì tiếp tục cấy truyền trên mặt môi trường thạch
Pseudomonas để phát hiện fluorescin và môI trường thạch Pseudomonas để phát hiện pyocyamin trong hộp Petri. Đậy và lật ngược hộp môi trường đã cấy truyền, đem ủ ấm ở 35 ± 20C trong ít nhất 3 ngày, đem kiểm tra các đĩa thạch dưới ánh đèn tử ngoại, nếy thấy:
Trên đĩa thạch Pseudomonas để phát hiện fluorescin có khuẩn lạc không màu đến màu vàng, có huỳnh quang hơi vàng.
Trên đĩa thạch Pseudomonas để phát hiện pyocyamin có khuẩn lạc màu vàng nhạt, có huỳnh quang màu xanh nước biển.
Tiếp tục nhuộm gram, soi kính và làm phản ứng oxydaza thấy trực khuẩn gram âm, phản ứng oxydaza dương tính, có thể kết luận có Pseudomonas aeruginosa.Nếu chưa chắc chắn có thể tiếp tục kiểm tra bằng các phép thử sinh hoá khác.
Thử phản ứng oxydaza: Chuyển khuẩn lạc vào mẩu giấy đã tẩm trước N-dimethyl phenylen diamin dihydroclorid, nếu thấy hiện mầu đỏ hồng, chuyển sang màu tím: phản ứng oxydaza dương tính.
2.5.2.3 Enterobacteriaceae và các vi khuẩn gam âm khác.
Làm đồng nhất chế phẩm đem kiểm tra bằng cách xử lý một lượng thích hợp như đã mô tả ở trên và ủ ấm ở 35-37 0 C trong một thời gian thích hợp để phục hồi lại vi khuẩn, nhưng không phảI làm tăng vi khuẩn (thường từ 2-5 h). Lắc bình chứa và chuyển một lượng chế phẩm đã đồng nhất tương đương với khoảng 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trường canh thang làm giầu Enterobacteriaceae - Mosel và ủ ấm ở 35-37 0C trong 18-24 h.Cấy lên đĩa thạch muối mật có lactose, glucose, chỉ thị tím tinh thể và đỏ trung tính, ủ ấm ở 35- 370C trong 18- 48 h. Chế phẩm không có Enterobacteriaceae nếu không thấy mọc những khuẩn lac vi khuẩn gram âm trên thạch đĩa.
Đánh giá số lượng: Ủ ấm một lượng thích hợp môi trường canh thang làm giầu Enterobacteriaceae - Mosel với nhữnglượng chế phẩm đem kiểm tra đã được làm giầu đồng nhất chứa 1,0 g; 0,1 g; và 0,01 g hoặc 1,0 ml; 0,1 ml và 0,01 m. Chế phẩm có thể được pha loãng khi cần. ủ ấn ở 350-370 C trong 24 đến 48 giờ. Sự mọc của các khuẩn lạc đã phát triển tốt thường đỏ hoặc đĩa đỏ, vi khuẩn gram âm chứng tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả dương tính và lượng lớn nhất của chế phẩm mà ở đó cho kết quả âm tính. Xác định theo bảng sau số lượng Bacteria
Kết quả đối với mỗi lượng sản phẩm
1,0 g hoặc 1,0 ml 0,1 g hoặc 0,1 ml 0,01 g hoặc 0,01 ml Số bacteria có trong 1 g sản phẩm + + + Lớn hơn 102
+ + - Ít hơn 10 2 nhưng lớn hơn 10
+ - - Ít hơn 10 nhưng lớn hơn 1
- - - Ít hơn 1
2.5.2.4 Tìm Candida albicans
Tiến hành trên môI trường thạch Sabouraud
Vào cuối giai đoạn ủ ấm, kiểm tra bằng kính hiển vi xem có nấm mọc hay không. Kiểm tra sự có khuẩn lạc nghi ngờ Candida albicans. Lấy khuẩn lạc đIển hình đem nhuộm gram, soi kính: Candida albicans có hình tròn, bầu dục đường kính 6-9 mm, bắt màu gram dương.
Lấy một giọt huyền dịch nấm đã nuôI cấy sau 24 h vào ống nghiệm nhỏ có chứa 1 ml huyết thanh thỏ, ủ ấm ở 370 C trong 3 h, sau đó lấy ra soi giữa bản và lá kính. Nếu là nấm Candida albicans thì gần như toàn bộ số tế bào sẽ nẩy mầm giống như hình - giá đậu .
Tìm tế bào vách dày: Cho môI trường RAT lên bản kính vô khuẩn, nhỏ vào một giọt huyền dịch nấm , đậy lá kính, đọc kết qảu sau 24 - 48 giờ ủ ấm ở 30 0C
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
___________________________________
Phụ lục
Bộ Y Tế Cộng hoà Xã hội Chủ nghĩa Việt nam
Số: 3113/1999/QQĐ-BYT Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
--- ---
Hà nội ngày 11 tháng 10 năm 1999
Quyết Định Của Bộ Trưởng Bộ Y Tế
Về việc ban hành Tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm và
Phương pháp thử kích ứng trên da
Bộ Trưởng Bộ Y Tế
-Căn cứ Luật bảo vệ sực khoẻ nhân dân ban hành ngày 11 / 7 /1989 và ĐIều lệ thuốc phòng bệnh, chữa bệnh ban hành kèm theo Nghị định số 23/ HĐBT ngày 24/02/1991 của Hội đồng Bộ trưởng (nay là Chính phủ);
-Căn cứ Pháp lệnh chất lượng hàng hoá ngày 27/12/1990 của Chủ tịch Hội đồng Nhà nước và Nghị định số 327/HĐBT ngày 19/10/1991 của Hội đồng Bộ trưởng(nay là Chính phủ) qui định thi hành Pháp lệnh chất lượng hàng hoá;
-Căn cứ Nghị định số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng nhiệm vụ , quyền hạn và tổ chức bộ máy Bộ Y tế;
-Căn cứ Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ quy định phân công trách nhiệm quản lý Nhà nước về chất lượng hàng hoá;
-Xét đề nghị của Cục trưởng Cục Quản lý Dược Việt nam;
Quyết Định
Điều 1: Nay ban hành kèm theo Quyết định này:
1-Tiêu chuẩn giới hạn vi khuẩn, nấm mốc trong mỹ phẩm
2- Phương pháp thử kích ứng trên da (áp dụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm)
Điều 2: Quyết định này có hiệu lực sau 15 ngày kể từ ngày ký ban hành. Các quy định trước đây trái với quy định trong Quyết định này đều bị bãi bỏ.
ĐIều 3: Các ông, Bà Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng Vụ đều trị, Vụ trưởng Vụ khoa học- Đào tạo- Bộ Y tế, Cục trưởng Cục Quản lý Dược Việt nam, Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm, Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ, Giám đốc Sở Y tế các tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương, Y tế ngành chịu trách nhiệm thi hành quyết định này.