Sắc kí cột silica gel áp dụng cho 20.90 g cao butanol giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 500ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gôm lại thành một phân đoạn. Kết quả được 6 phân đoạn (I-VI), các phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2 và bảng 2.
Sơ đồ 2: Các phân đoạn được tạo thành từ cao butanol
2.4.1 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn III ( sơ đồ 2).
Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn III (2.50g), giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 250ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần
I (1.34g) III (2.50g) V (5.20 g) Cao butanol 20.90 g + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C : M
+ Cô quay thu hồi dung môi.
II (1.20g) IV (5.28 g) VI (1.45 g)
giống nhau gôm lại thành một phân đoạn. Kết quả được 4 phân đoạn (III.1-III.4), các phân đoạn được trình bày trong bảng 3.
Phần cao thu được từ phân đoạn III.2 có khối lượng(1.10g) . Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Kết quả thu được chất bột màu trắng (17mg). Kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi C : M (4 : 1) cho một vết rõ, màu tím, Rf = 0.45. Hợp chất này được kí hiệu là LIEN- Bu1.
2.4.2 Sắc kí cột silicagel cho phân đoạn V (bảng 2).
Sắc kí bản mỏng cho phân đoạn V có khối lượng (5.20 g) thu được trong cao butanol cho thấy có vết màu tím và vết rõ. Tiến hành sắc kí cột silica gel áp dụng cho 5.20g của phân đoạn V, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 500ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gôm lại thành một phân đoạn. Kết quả được 5 phân đoạn ( V.1-V.5), các phân đoạn được trình bày trong bảng 4.
2.4.2.1 Sắc kí cột pha đảo cho phân đoạn V.3 ( bảng 4).
Tiến hành sắc kí bản mỏng pha thường cho phân đọan V.3 có khối lượng 2.60 g, với hệ dung môi giải ly C:M:H (7:3:0.5) cho thấy vết tách không rõ (hình 5).
Tiến hành sắc kí bản mỏng pha đảo cho phân đọan V.3 có khối lượng 2.60 g, với hệ dung môi giải ly M:H (7:3) cho thấy vết tách rõ (hình 6).
Hình 6: Sắt kí bản mỏng pha đảo cho phân đoạn V.3
Từ kết quả trên, tiến hành sắc kí cột silica gel pha đảo RP – 18 cho phân đoạn V.3 (2.60 g), giải ly bằng hệ dung môi M : H (1 : 1). Kết quả thu được 4 phân đoạn (V.3.1- V.3.4), được trình bày ở bảng 5.
2.4.2.2Sắc kí cột pha đảo cho phân đoạn V.3.3 ( bảng 5).
Tiếp tục sắc kí cột silica gel pha đảo cho phân đoạn V.3.3 có khối lượng 0.65g , giải ly bằng hệ dung môi M:H (1:1). Kết quả thu được 3 phân đoạn ( V.3.3.1-V.3.3.3), được trình bày trong bảng 6.
2.4.2.4 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn V.3.3.2 ( bảng 6).
Phần cao thu được từ phân đoạn V.3.3.2 có khối lượng (0.25 g). Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Kết quả thu được chất bột màu trắng (36mg). Kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng với hệ dung môi C : M : H (7:3:0.5) cho một vết rõ, màu tím, Rf = 0.25. Hợp chất này được kí hiệu là LIEN-Bu2.
Bảng 2: Sắc kí cột silica gel trên cao butanol (20.90 g). Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng cao (g) Kết quả sắc kí bản mỏng Ghi chú I 100% C 1.34 g Vết không rõ Chưa khảo sát
II C:M
19:1 1.20 g Vết không rõ Chưa khảo sát
III C:M
9:1 2.50 g Vết rõ Khảo sát thu được LIEN-Bu1(17 mg)
IV C:M
(4:1) 5.28 g Vết rõ Sv.Nguyễn Trần
Bảo Huy khảo sát
V C:M
(7:3) 5.20 g Vết rõ Khảo sát thu được LIEN-Bu2(36 mg)
VI C:M:H
(7:3:0.5) 1.45 g Vết không rõ Chưa khảo sát Ghi chú: C: cloroform, M: methanol, H: nước
Bảng3: Sắc kí cột silicagel cho phân đoạn III (2.50g). Phân
đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng cao (g)
Kết quả sắc kí
bản mỏng Ghi chú
III.1 C:M
9:1 0.50 g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát
III.2 C:M
4:1 1.10 g Vết tím còn dơ rất ít được LIEN-Bu1 Khảo sát thu
III.3 C:M
4:1 0.20 g
Vết vàng lẫn nhiều
vết dơ Chưa khảo sát III.4 C:M
Bảng 4: Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn V (5.20g).
Bảng 5: Sắc kí cột pha đảo cho phân đoạn V.3 (2.60g).
Phân
đoạn Dung môi giải ly
Trọng lượng cao (g) Kết quả sắc kí bản mỏng Ghi chú V.3.1 M:H
2:3 0.25g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát
V.3.2 M:H
1:1 0.15g
Vết tím không rõ ràng Chưa khảo sát
V.3.3 M:H
1:1 0.65g
Vết tím rõ ràng Khảo sát thu được LIEN-Bu2
V.3.4 M:H
3:2 0.11g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng cao (g) Kết quả sắc kí bản mỏng Ghi chú V.1 C:M
4:1 0.30g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát
V.2 C:M
7:3 0.70g
Có vết màu tím kèm
theo nhiều vết dơ Chưa khảo sát
V.3 C:M:H
7:3:0.5 2.60g Có vết tím rõ ràng được LIEN-Bu2 Khảo sát thu
V.4 C:M:H
3:2:0.2 0.25g Vết không rõ ràng Chưa khảo sát
V.5 C:M
Bảng 6: Sắc kí cột pha đảo cho phân đoạn V.3.3 (0.65g). Phân đoạn Dung môi
giải ly Trọng lượng cao (g) Kết quả sắc kí bản mỏng Ghi chú V.3.3.1 M:H
1:1 0.10 g Vết không rõ Chưa khảo sát
V.3.3.2 M:H
1:1 0.25 g Vết rõ được LIEN-Bu2 Khảo sát thu
V.3.3.3 M:H
7:3 0.08 g
Nhiều vết chồng
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT LIEN-Bu1.
Hợp chất LIEN-Bu1 thu được từ phân đoạn III.2 của vỏ thân cây Polyscias guilfoylei Bail có những đặc điểm sau:
- Chất bột vô định hình màu trắng.
- Phổ 1H-NMR ( phụ lục 1) cho thấy: δppm: 4.31 ( -O-CH-O, d, J=7.5 Hz); 5.44 (=CH-, dt, J=5.0/2.5 Hz); 1.35-1.31 (-CH2-); 0.92 (-CH3, t, J=7.0 Hz).
- Phổ 13C-NMR ( phụ lục 2) cho thấy: δppm: 177.1 (>C=O); 131.5; 131.3 (=CH-); 78.0-71.5 (>CH-O-); 51.6 (>CH-N); 62.6 (-CH2-OH); 35.7-23.7 (-CH2-); 14.4 (-CH3). - Phổ COSY, HSQC, HMBC (phụ lục 4, 5, 6).
BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:
Phổ 1H-NMR và HSQC ( phụ lục 1, 5) cho thấy ) cho thấy có một proton anomer ở δ 4.31 (d, J = 7.5 Hz) tương ứng với carbon anomer có δC 104.6 ppm, như vậy trong cấu trúc của hợp chất LIEN-Bu1 có một phân tử đường.
Ngoài ra trong phổ 1
H-NMR còn xuất hiện hai proton olefin tại δH 5.44 ( dt,
J=5.0/2.5 Hz), các proton của nhóm metylen –CH2- cộng hưởng trong vùng (δH 1.35- 1.31 ppm) và 6 proton của hai nhóm metyl –CH3 nằm cuối mạch dài cộng hưởng ở vùng δH 0.92 (t, J = 7.0 Hz).
Phổ 13
C-NMR kết hợp với DEPT-NMR, (phụ lục 2,3) cho thấy hợp chất này có một carbon tứ cấp >C=O amid (δC 177.1 ppm), một carbon đặc trưng cho C-N (δC
51.6 ppm) hai carbon olefin –CH= (δC 131.5 và 131.3 ppm), 7carbon loại >CH-O- (δC
78.0 -71.5 ppm), một carbon loại –CH2-OH (δC 62.6 ppm), một carbon loại –O-CH2- (δC 69.9), các –CH2- (δC 35.7-23.7 ppm ) và carbon –CH3 nằm ở cuối mạch dài (δC
14.4 ppm).
Từ những dữ liệu trên cho thấy LIEN-Bu1 là một cerebrosid có gắn một phân tử đường.
Phổ HSQC cho phép gán các tín hiệu proton và carbon tương ứng. Proton anomer δH 4.31 (d, J = 7.5 Hz, H-1") có tương quan 1H-1H COSY đến xâu chuỗi H- 2"/H-3"/ H-4"/H-5"/H-6" trong vùng δH 3.20-3.38 và vùng δH (3.70-3.90). Từ đó
có thể gán các tín hiệu carbon dựa vào phổ HSQC. Phổ HMBC thể hiện một số tương quan như H-1" với C-3" (δC 78.0); H-2" với C-1" (δC 104.6), C-3"( δC 78.0), C-4" ( δC 71.5); H-4" với C-3" (δC 78.0), C-5" (δC 77.9), C-6" (δC 62.6).
Như vậy phần đường glucose có cấu hình β do hằng số ghép của proton anomer là 7.5 Hz.
Tương quan HMBC từ tín hiệu proton anomer H-1" (δH 4.31) đến tín hiệu δC
69.9 ( C-1), cho nên phân tử đường gắn qua vị trí C-1. Proton có δH 3.62 có tương quan HMBC đến các tín hiệu δC 69.9 (C-1), δC 51.6 ( C-2), δC 73.0 nên C-3 có gắn nhóm –OH, tương quan 1
H-1H COSY giữa tín hiệu δH 3.62 và δH 3.54 vậy C-4 có gắn nhóm –OH
Tương quan HMBC cho thấy từ tín hiệu δH 3.62 (H-3) đến tín hiệu có δC 33.0 (C-5), từ tín hiệu δH 3.54 (H-4) đến tín hiệu δC 27.1 ( C-6), δH 2.05 (H-7) đến δC 131.5, 131.3. Các tương quan xâu chuỗi trong 1H-1H COSY từ tín hiệu H-4 đến H-5/H-6/H- 7/H-8. Như vậy, LIEN-Bu1 là cerebrosid với phần ceramid gồm 2 phần: phần acid là acid béo có mang nhóm hydroxyl –OH ở vị trí số 2', phần aminoalcol có mang 3 nhóm hydroxyl ở vị trí 1, 3, 4 và có nối đôi ở vị trí số 8, hai proton olefin có hằng số ghép J
= 5 chứng tỏ hai proton ghép cis với nhau. Phần đường β–D-glucose với các số liệu phổ NMR được trình bày trong bảng 7. Tuy nhiên các dữ liệu phổ NMR chưa xác định được chiều dài của mạch carbon.
Khi so sánh số liệu phổ NMR của hợp chất LIEN-Bu1 với số liệu phổ của hợp chất aralia cerebrosid [40]
, cho thấy sự tương đồng cho nên đề nghị cấu trúc của hợp chất LIEN-Bu1 là: N O OH OH O H O HO OH HO OH m n OH
Bảng 7: Số liệu phổ NMR của hợp chất LIEN-Bu1 STT Hợp chất LIEN-Bu1 Aralia cerebrosid δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) HMBC (1H-13C) δC(ppm) 1 4.07 (dd, 10.5/6.5; 3.83(dd, 10.5/4.0) 69.9 1", 3 70.5 2 4.28, m 51.6 1 51.7 3 3.62, ( dd, 12.5/6.5) 75.6 1,2,4 75.9 4 3.54 ( dt, 6.5) 73.0 72.4 5 33.0 - 6 27.1 - 7 33.7 32.1 8 5.44, (dt, 5.0/2.5) 131.5 9, 10 130.8 9 5.44( dt, 5.0/2.5) 131.3 8, 10 130.6 10 33.7 33.0 (-CH2-)n 35.7-23.7 -CH3 0.92 (t, 7.0) 14.4 1' 177.1 175.6 2' 4.0 (t, 3.5) 72.9 1', 3' 72.4 (-CH2-)m 35.7-23.7 -
3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT LIEN-Bu2
Hợp chất LIEN-Bu2 (36 mg) thu được từ phân đoạn V.3.3.3 của vỏ thân cây
Polyscias guilfoylei Bail có những đặc điểm như sau: - Hợp chất ở dạng bột vô định hình, màu trắng.
- Phổ LC-MS (phụ lục 7, 8) cho mũi ion giả phân tử với m/z= 955.29 [M-H]-1
- Phổ 1H-NMR (pyridin-d5) ( phụ lục 9) δppm: 5.97 ( d, J=8.5 Hz); 5.29 ( br s); 5.23 (d, J=7.5 Hz); 4.97 ( d, J=8.0 Hz); 4.77 ( 1H, d, J=8.5 Hz); 4.75 (1H, d, J=8.5 Hz); 3.21 ( dd, J=10.5/4.0 Hz); 2.99 ( d, J=10.5 Hz).
- Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT-NMR ( pyridin-d5), (phụ lục 10, 11), δppm: 176.8 (>C=O), 175.3 (>C=O), 143.5 (=C<), 122.3 (-CH=); 105.3; 105.0; 103.8; 103.4; 94.8 (-O-CH-O), độ dịch chuyển hóa học của các carbon khác được trình bày trong bảng 8, 9.
- Phổ COSY, HSQC, HMBC (phụ lục 12, 13, 14)
BIỆN LUẬN CẤU TRÚC:
Phổ 13
C-NMR kết hợp với phổ DEPT-NMR cho thấy LIEN-Bu2 có các proton anomer cộng hưởng trong vùng δC 105.3-94.8 ppm, các proton loại >CH-O- cộng hưởng trong vùng δC 70.1-85.4 ppm. Chứng tỏ, LIEN-Bu2 là saponin với phần
-CH3 0.92 (t, 7.0) 14.4 - 1" 4.31, (d, 7.5) 104.6 1, 2", 3" 105.6 2" 3.20 (dd, 9.0/8.0) 75.0 1", 3", 4" 75.1 3" 3.30 (dd) 78.0 4", 5" 78.4 4" 3.30 (dd) 71.5 3", 5", 6" 71.4 5" 3.38 (t,9.0) 77.9 4" 78.6 6" 3.90 ( d,10.5); 3.70 (d, 5.5) 62.6 4", 5" 62.6
aglycon là acid oleanolic được xác định qua hai mũi cộng hưởng đặc trưng của carbon olefin C-12 và C-13 ở δC 122.3 (-CH=, C-12); 143.5 (=C<, C-13); cùng với các mũi cộng hưởng ở vùng từ trường cao.
Phần aglycon là acid oleanolic còn được tái xác định qua các mũi cộng hưởng đặc trưng trong phổ 1H-NMR. Proton olefin H-12 cộng hưởng ở δH 5.29 ( br s ); proton H-3 (>CH-O-) tại δH 3.21 ( dd, J= 10.5/4.0 Hz); proton H-18 (>CH-) cộng hưởng ở δH 2.99 ( d, J=10.5), cùng với sự xuất hiện các mũi đơn ở vùng từ trường cao là những mũi cộng hưởng đặc trưng cho proton, của 7 nhóm –CH3 gắn vào carbon tứ cấp của acid oleanolic ở δH 1.11, 0.88, 0.82, 0.77, và 0.64. Phần đường còn được thể hiện qua các mũi cộng hưởng của proton anomer tại δH 5.97 ( d, J=8.5 Hz); 5.23 (d,
J=7.5 Hz); 4.97 ( d, J=8.0 Hz); 4.77 ( d, J=8.5 Hz); 4.75 ( d, J=8.5 Hz).
Phổ HSQC và HMBC còn cho thấy carbon C-3 của acid oleanolic cộng hưởng tại δC 89.4 và 89.3 ppm; hai proton anomer có δH 4.77 và δH 4.75 tương quan với C-3 của acid oleanolic, như vậy hợp chất LIEN-Bu2 có hai carbon C-3 và hai carbon này có gắn đường. Do đó LIEN-Bu2 là hỗn hợp hai saponin có chung phần aglycon là acid oleanolic, đều này cũng phù hợp với phổ đồ LC-MS của hợp chất LIEN-Bu2. Trong phổ đồ LC có hai pic với thời gian lưu nằm sát nhau (11.26 và 11.35). Chứng tỏ LIEN- Bu2 là hỗn hợp hai chất .
Saponin thứ nhất ( LIEN-Bu2a).
Như đã trình bày ở trên, phổ HMBC cho thấy sự tương quan giữa proton anomer δH 4.77 ( H-1'a) với C-3 có δC 89.3, như vậy LIEN-Bu2a có phân tử đường gắn qua C-3 của acid oleanolic .
Phổ COSY, HSQC, HMBC giúp xác định được vị trí của các phân tử đường gắn vào nhau và nối vào aglycon .
Phổ COSY xuất hiện sự tương quan giữa proton anomer H-1'a với proton δH
4.03 ( m ), cho nên H-2'a có δH là 4.03. Tương tự, phổ COSY sẽ giúp xác định các proton H-3'a, H-4'a, H-5'a.
Phổ HSQC thể hiện sự tương quan giữa proton anomer H-1'a với carbon có δC
105.0 nên C-1'a có δC là 105.0. Các proton H-2'a, H-3'a, H-4'a, H-5'a lần lượt tương quan với các carbon có δC 74.3 ( C-2'a); 85.4 ( C-3'a); 70.3 ( C-4'a); 75.5 ( C-5'a).
Phổ HMBC giúp xác định lại các proton cũng như các carbon qua một số tương quan như: H-2'a với C-1'a; H-2'a, H-4'a, H-5'a với C-3'a. Bên cạnh đó, phổ HMBC còn xuất hiện tương quan giữa H-4'a, H-5'a với carbon cacboxyl có δC 175.3 (-COOH). Do đó, phân tử đường thứ nhất gắn qua C-3 của acid oleanolic là đường acid glucuronic.
Ngoài ra, trong phổ HMBC còn xuất hiện tương quan giữa proton anomer δH
5.23 ( d, J=7.5 Hz) với carbon C-3'a (δC 85.4); proton anomer δH 5.97 ( d, J=8.5 Hz) với C-28 của acid oleanolic (δC 176.8), như vậy phân tử đường thứ hai ( đường glucose) gắn vào đường acid glucuronic qua C-3'a, phân tử đường thứ 3 ( đường glucose) gắn qua C-28 của acid oleanolic. Ba phân tử đường điều có cấu hình β do hằng số ghép của 3 proton anomer là 7.5-8.5 Hz.
Độ dịch chuyển hóa học của các proton và carbon của phân tử đường thứ2 và phân tử đường thứ 3 được xác định dựa vào phổ COSY, HMBC, HSQC và được trình bày trong bảng 8.
Như vậy, hợp chất LIEN-Bu2a được dự đoán là một saponin có phần aglycon là acid oleanolic , phần có 3 phân tử đường gồm: 1 phân tử đường acid glucuronic và 2 phân tử đường glucose . Khi đó, công thức của LIEN-Bu2a là C48H76O19. Phổ LC-MS (ghi nhận ion âm) cho mũi ion giả phân tử ở m/z=955.29 ([M-H]-1 phù hợp với công thức phân tử C48H76O19 , M=956.
Từ những dữ liệu trên khi so sánh với số liệu phổ nghiệm của hợp chất acid 3-
O-β-D-glucopyranosyl-(13)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic.[14]
,có nhiều điểm tương đồng nên đề nghị cấu trúc của hợp chất LIEN-Bu2a là: 3-O-β-D-
glucopyranosyl-(1→3)-
glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β-D-glucopyranosyl ester (LIEN-Bu2a). Saponin thứ 2 (LIEN-Bu2b.
Như đề cập ở trên, tương tự LIEN-Bu2a , LIEN-Bu2b cũng là một saponin có phần aglycon là acid oleanolic , có phân tử đường gắn qua C-3 của acid oleanolic qua tương tác của proton anomer có δH 4.75 với C-3 (δC 89.4)
Việc xác định vị trí của các phân tử đường gắn vào nhau và nối vào aglycon được dựa vào các phổ COSY, HSQC, HMBC. Tương quan HMBC từ δH 4.75 ( d,
gắn vào acid oleanolic qua C-3. Proton anomer H-1'b có tương quan 1
H-1H COSY đến xâu chuỗi H-2'b/H-3'b/H-4'b/H-5'b. Phổ HSQC cho phép gắn các tín hiệu proton và carbon tương ứng.Tương quan HMBC từ tín hiệu δH 4.32 ( H-5'b) đến carbon cacboxyl δC 175.3 cho biết phân tử đường thứ nhất là đường acid glucuronic.
Phân tử đường thứ 2 ( đường glucose) gắn vào đường acid glucuronic tại C-4', được xác định qua tương quan HMBC từ tín hiệu δH 4.97 ( d, J=8.0 Hz, H-1"b) đến tín hiệu δC 82.2 ( C-4'b). Phân tử đường thứ 3 (đường glucose) gắn vào acid oleanolic qua tương quan HMBC từ tín hiệu δH 5.97 ( d, J=8.5 Hz) đến tín hiệu δC 176.8 (C-28). Các phân tử đường này cũng có cấu hình β do hằng số ghép của ba proton anomer này