Phân đoạn EA3 (22.25g) cho SKLM nhiều vết, có vết tách rõ nên phân đoạn EA3
được thực hiện SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải C:Me (0-30% Me). Kết quả thu được 7 phân đoạn EA3.1-EA3.7, được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3 của cao ethyl acetate STT Phân đoạn Dung môi
giải ly Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 EA3.1 C 1.82 Vệt dài Khảo sát
2 EA3.2 C:Me 95:5 1.23 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát
3 EA3.3 C:Me 9:1 0.85 Nhiều vết, tách rõ Thu được PEH1
4 EA3.4 C:Me 85:15 1.88 Vệt dài Chưa khảo sát 5 EA3.5 C:Me 8:2 2.55 Vệt dài Chưa khảo sát
Ghi chú:C(Chloroform), Me (Methanol)
2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3.3
Phân đoạn EA3.3 (0.85 g) cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn EA3.3được SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải C:Me 9:1. Kết quả thu được 5 phân đoạn
EA3.3.1-EA3.3.5, được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3.3
STT Phân đoạn Dung môi giải ly
Trọng
lượng (mg)
Sắc kí lớp mỏng Ghi chú
1 EA3.3.1 C 132.4 Nhiều vết Chưa khảo sát 2 EA3.3.2 C:Me 9:1 72.0 Nhiều vết, kéo vệt Khảo sát
3 EA3.3.3 C:Me 87:13 54.3 Tách vết rõ Thu được PEH1
4 EA3.3.4 C:Me 8:2 143.4 Kéo vệt Chưa khảo sát 5 EA3.3.5 C:Me 8:2 186.1 Kéo vệt Chưa khảo sát
Ghi chú: C (chloroform), Me (methanol)
Phân đoạn EA3.3.3 (54.3 mg) được SKC silica gel nhiều lần với hệ dung môi C:Me (87:13) thu được 15.0 mg hợp chất dạng dầu, màu vàng, đặt kí hiệu là PEH1.
2.5 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG CAO HEXANE CỦA RỄ 2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane của rễ 2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane của rễ
Trích 1.1g từ 6.1g cao hexane của rễ, SKC với hệ dung môi giải ly H:DCM có độ phân cực tăng dần (0-100% DCM), tiếp theo giải ly với hệ dung môi DCM:Me có độ phân cực tăng dần (0-30% Me). Kết quả thu được 9 phân đoạn, kí hiệu từRH1 – RH9. Kết quảđược trình bày ở bảng 2.4.
Bảng 2.4 Sắc kí cột trên cao hexane của rễ STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 RH1 H:DCM 4:1 18.2 Vệt dài Chưa khảo sát 2 RH2 H:DCM 2:3 378.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 RH3 H:DCM 1:4 15.5 Nhiều vết Chưa khảo sát 4 RH4 H:DCM 1:4 20.3 Nhiều vết Chưa khảo sát 5 RH5 DCM 45.4 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát
6 RH6 DCM:Me 97:3 158.7 Tách vết rõ Đã khảo sát
7 RH7 DCM:Me 9 :1 72.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 8 RH8 DCM:Me 9:1 35.2 Vệt dài Chưa khảo sát 9 RH9 DCM:Me 9: 1 101.2 Vệt dài Chưa khảo sát
Ghi chú: H (hexane), DCM (dichloromethane), Me (Methanol)
2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ
Phân đoạn RH6 (158.7 mg) được SKC silica gel bằng hệ dung môi H:DCM với độ phân cực tăng dần (0-100% DCM). Kết quả thu được 5 phân đoạn, kí hiệu từ RH6.1 –
RH6.5. Kết quảđược trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5 Sắc kí cột trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghi chú 1 RH6.1 DCM 22.3 Vệt dài Chưa khảo sát
2 RH6.2 DCM 24.4 Nhiều vết,vệt dài Chưa khảo sát 3 RH6.3 DCM: Me 97:3 26.1 Nhiều vết,vệt dài Chưa khảo sát
4 RH6.4 DCM:Me 95:5 38.8 Tách vết rõ Thu được PEAC1
5 RH6.5 DCM: 95:5 23.1 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: DCM (dichloromethane), Me (methanol)
Phân đoạn RH6.4 được SKC silica gel nhiều lần với hệ dung môi DCM :Me 95:5 và SKC silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi Ac: Me (2:1) thu được 8.0 mg chất rắn, màu trắng, được kí hiệu là PEAC1.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEH1
Hợp chất PEH1 (15.0 mg) thu được từphân đoạn EA3.3.3 của bảng 3 có những đặc điểm sau:
- Dạng dầu màu vàng.
- SKLM với hệ giải ly C:Me 87:13 cho một vết duy nhất, hiện hình với thuốc thử H2SO4 20% cho vết màu đen.
- Phổ 1
H-NMR (MeOD, phụ lục 1), δH (ppm): 4.71, 4.20, 3.90, 3.84, 3.31, 3.20 và các độ dịch chuyển khác được trình bày trong bảng 3.1.
- Phổ 13
C-NMR (MeOD, phụ lục 2), δC (ppm): 105.4, 101.2, 78.0, 77.9, 75.1, 75.0, 73.5, 71.8, 71.6, 62.7, 57.3, 55.5 và các độ dịch chuyển khác được trình bày trong bảng 3.1.
- Phổ COSY, HSQC, HMBC (MeOD, phụ lục 3, 4 và 5 ).
Biện luận cấu trúc
Phổ 1
H-NMR của hợp chất PEH1 xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên carbon mang oxygen trong vùng δH 4.80-3.10. Trong đó, hai cặp tín hiệu cộng hưởng tại δH 4.71 (1H, d, J=3.5 Hz) và δH 4.20 (1H, d, J= 8.0 Hz) là những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của proton anomer.
Phổ 13
C-NMR cho thấy hai tín hiệu cộng hưởng của carbon anomer ở δC 101.2 và 105.3. Ngoài ra, phổ đồ còn thể hiện những tín hiệu cộng hưởng của carbon mang oxygen
của đường trong vùng δC 105.3-62.7. Từ đó, cho phép dự đoán hợp chất PEH1 có hai phân tử đường.
Phổ HSQC cho thấy proton anomer cộng hưởng tại δH 4.71 (H-1a) tương quan với carbon anomer cộng hưởng tại δC 101.2 (C-1a). Tương tự, proton cộng hưởng tại δH 4.20 (H-1b) cho tương quan với carbon anomer cộng hưởng tại δC 105.3 (C-1b).
Phổ COSY của hợp chất PEH1 thể hiện sự tương quan giữa proton anomer δH 4.71 (H-1a) và proton cộng hưởng tại δH 3.42 ( H-2a), còn proton anomer δH 4.20 (H-1b) lại cho tương quan với proton cộng hưởng tại δH 3.20 (H-2b).
Ngoài ra, phổ HMBC còn giúp xác định thêm cấu trúc của hai phân tử đường. Theo đó, proton anomer của phân tử đường thứ nhất δH 4.71 cho tương quan HMBC với các carbon cộng hưởng tại δC 75.1 ( C-3a), δC 55.5 (-OCH3). Proton cộng hưởng tại δH 3.44 (-OCH3) cho tương quan với carbon δC 101.2 (C-1a). Như vậy tại vị trí C-1 của phân tử đường thứ nhất gắn -OCH3. Các tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.1.
Tương tự, phổ HMBC cũng thể hiện sự tương quan giữa proton anomer của phân tử đường thứ hai δH 4.20 với carbon của nhóm methoxy (δC 57.3) và ngược lại. Từ đó cho thấy nhóm -OH vị trí C-1b của phân tử đường thứ hai tại đã bị methyl hóa.
Tuy nhiên, phổ HMBC không xuất hiện sự tương quan nào giữa hai phân tử đường. Qua các dữ liệu phổ NMR trên, có thể dự đoán hợp chất PEH1 là hỗn hợp 2 phân tử đường. Phân tử đường thứ nhất có các nguyên tử carbon cộng hưởng tại δC 101.2, 77.9, 75.1, 73.5, 71.8, 62.7 và phân tử đường thứ hai có các nguyên tử carbon cộng hưởng tại δC 105.4, 78.0, 75.0, 73.5, 71.6, 62.7.
Proton anomer H-1a của phân tử đường thứ nhất có hằng số ghép J= 3.5 Hz nên phân tử đường thứ nhất có cấu hình α. Proton H-1b phân tử đường thứ hai có hằng số ghép J= 8.0 Hz nên phân tử đường thứ hai có cấu hình β.
Từ những dữ liệu NMR, hợp chất PEH1được đề nghị là hỗn hợp hai phân tử đường. Phân tử đường thứ nhất là 1-O- methyl-α-D-glucopyranoside (PEH1-a) và phân tử đường thứ hai là 1-O- methyl-β-D-glucopyranoside (PEH1-b).
O HO HO OCH3 OH OH O HO HO OCH3 OH OH 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1-O-methyl-α-D-glucopyranoside 1-O-methyl-β-D-glucopyranoside
(PEH1-a) (PEH1-b)
Hình 3.1 Một sốtương quan HMBC của hợp chất PEH1-a và PEH1- b
O HO HO OCH3 OH OH O HO HO OCH3 OH OH
1-O-methyl-α-D-glucopyranoside 1-O-methyl-β-D-glucopyranoside (PEH1-a) (PEH1-b)
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ1
H-NMR và 13C-NMRcủa hợp chất PEH1
Vị trí PEH1-a (CD3OD) PEH1-b (CD3OD)
δH (ppm), J(Hz) δC (ppm) δH (ppm), J(Hz) δC (ppm) 1 4.71 (d, 3.5) 101.2 4.20 (d,8.0) 105.3 2 3.42 (dd, 9.5/4.0) 73.5 3.20 (dd, 9.0/8.5) 75.0 3 3.65 (dd, 9.0/8.5) 75.1 3.30 (dd, 10.0/9.0) 78.0 4 3.31 (m) 71.8 3.32 (m) 71.6 5 3.33 (m) 77.9 3.55 (m) 73.5 6 3.84, 3.70 (m) 62.7 3.84, 3.70 (m) 62.7 1 -OCH3 3.44 (s) 55.5 3.57 (s) 57.3 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEAC1
Hợp chất PEAC1 (8.0 mg) thu được từphân đoạn RH6.4 có những đặc điểm sau: - Dạng tinh thể màu trắng.
- SKLM với hệ giải ly DCM:Me 95:5 cho một vết duy nhất, hiện hình với thuốc thử H2SO4 20% cho vết màu nâu.
- Phổ 1
H-NMR (CDCl3 + MeOD, phụ lục 6a và 6b), δH (ppm) : 5.58, 4.87, 4.84, 1.2, 1.00, 0.96, 0.93, 0.91 và 0.82 và các độ chuyển dịch khác được trình bày trong bảng 3.2.
- Phổ 13
C-NMR (CDCl3 + MeOD, phụ lục 7a và 7b), δC (ppm): 182.5, 175.3, 151.3, 111.0 và các độ chuyển dịch khác được trình bày trong bảng 3.2.
- Phổ DEPT, COSY, HSQC, HMBC (CDCl3 + MeOD, phụ lục 8a,8b,9,10,11a và 11b).
- Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 12).
Biện luận phổ
Phổ 1
H-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của proton olefin ở δH 5.58 (1H, dd, J= 17.0 /10.5Hz), 4.86 (1H, dd, J= 10.5/1.5Hz) và 4.84 (1H, dd, J= 17.5/1.0Hz), proton của
Phổ 13
C-NMR kết hợp với kĩ thuật DEPT cho thấy có ba mươi carbon, nên dựđoán hợp chất cô lập được là triterpene. Trong đó có hai carbon olefin loại –CH2=CH– cộng hưởng ở δC 151.3 và 111.0, sáu carbon tứ cấp loại >C< , ba carbon >CH–, mười một carbon >CH2 , sáu carbon methyl. Ngoài ra, phổ đồ còn xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của hai carbon >C=O ởδC 182.5 và 175.3.
Cấu trúc của các triterpene nămvòng thường có nhóm –OH gắn tại C-3 hoặc tại C-3 là >C=O [7]. Trong cấu trúc của hợp chất PEAC1 không có tín hiệu cộng hưởng 1H- NMR và 13C-NMR cho thấy C-3 gắn –OH hoặc C-3 trở thành >C=O. Kết hợp dữ kiện nối đôi olefin dạng –CH=CH2 và sáu nhóm methyl gắn trên carbon tứ cấp, các tín hiệu >CH– tại δC 58.6, 53.4 và 42.8 dự đoán hợp chất là triterpene có khung sườn friedelan với vòng A bị phá vỡ.
Phổ COSY cho thấy proton cộng hưởng tại δH 2.23 (H-2) tương quan với proton cộng hưởng tại δH 1.38, 1.50 (H-1), proton cộng hưởng tại δH 1.54 (H-18) cho tương quan với proton cộng hưởng tại δH 1.90, 1.25 (H-19).
Phổ HMBC cho thấy proton >CH– cộng hưởng ởδH 0.84 (t, J= 4.0) tương quan với carbon olefin cộng hưởng tại δC 151.3, methyl δC 18.0 (–CH3), proton olefin ở δC 5.58 cho tương quan với các carbon ởδC 58.6 (>CH–, C-10), 42.38 (>C<, C-5) và 18.0 (–CH3 , C-24). Hai proton olefin còn lại cho tương quan HMBC với carbon cộng hưởng ở δC 42.4 (C-5), 151.3 (=CH, C-4). Do đó, hợp chất PEAC1 được dựđoán nối đôi –CH=CH2 nằm ở vị trí C-4 – C-23. Proton của hai nhóm methylen khác ở δH 2.40 (H-21) và 1.90 (H-19) cũng cho tương quan HMBC với carbon nhóm –COOH ( δC 182.5), proton của nhóm methyl cộng hưởng ở δH 1.20 (H-30) cũng cho tương quan HMBC với carbon – COOH ởδC 182.5, nên cho phép dựđoán C-29 của khung friedelan đã trở thành –COOH. Các tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.3.
Khối phổ phân giải cao cho mũi ion phân tử giả [M-H]- tại m/z = 471.3472, phù hợp với công thức phân tử C30H48O4 [M-H]- = 471.3474.
Từ tất cả dữ liệu NMR, kết hợp so sánh dữ liệu NMR của hai hợp chất 3,4- secofriedelan-3,28-dioic acid [4] và hợp chất 3-oxofriedelan-29-oic acid [7] có những điểm tương đồng nên cấu trúc của hợp chất được đề nghị là 3,4-secofriedel-4(23)-en- 3,29-dioic acid.
Đây là hợp chất mới trong tựnhiên đã được xác định bằng phần mềm Scifinder vào ngày 16/5/2016 tại Đại học Jhong-Li, Taiwan.
HOOC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24 11 12 13 14 26 27 18 15 16 17 19 20 21 22 28 25 29 30 HOOC
3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid (PEAC1)
HOOC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24 11 12 13 14 26 27 18 15 16 17 19 20 21 22 28 25 29 30 HOOC HOOC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 23 24 11 12 13 14 26 27 18 15 16 17 19 20 21 22 28 25 29 30 HOOC
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ1
H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEAC1
Vị trí
PEAC1 (CDCl3+CD3OD) 3,4-secofriedelan- 3,28-dioic [4] 3-oxofriedelan-29- oic acid [7] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δC (ppm) δC (ppm) 1 1.50 (m), 1.38 (m) 21.8 22.55 22.2 2 2.23 (m) 37.6 38.93 41.3 3 175.3 177.88 213.3 4 5.58 (dd,17.0/10.5) 151.3 37.17 58.2 5 42.4 38.84 42.1 6 41.8 39.96 41.3 7 18.2 19.06 18.2 8 53.4 54.32 50.7 9 38.4 40.38 37.4 10 0.84 (t, 3.5) 58.6 60.83 59.8 11 35.5 36.21 35.3 12 30.2 32.01 30.2 13 40.5 38.84 39.1 14 39.0 39.96 39.2 15 33.0 33.83 29.7 16 35.8 30.82 36.1 17 29.8 45.84 30.1 18 1.54 (m) 42.8 39.09 44.2 19 1.90 (dd), 1.25 (m) 31.7 35.97 29.5 20 40.0 29.40 40.4 21 28.7 33.66 29.5 22 38.7 37.10 36.6 23 4.86 (dd, 10.5/1.5), 4.84 (dd, 17.5/1.0) 111.0 7.94 6.2 24 0.93 (s) 18.0 19.89 14.6 25 0.82 (s) 17.9 18.11 18.0 26 0.91 (s) 21.0 21.27 18.4 27 0.96 (s) 18.3 19.14 16.3 28 1.00 (s) 32.1 182.69 31.8 29 182.5 30.31 184.5
30 1.20 (s) 32.1 35.03 31.6
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
4.1KẾT LUẬN
Từ dịch chiết cao ethyl acetate của lá thu được hợp chất PEH1. Cấu trúc của hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm, đó là hỗn hợp 1-O-methyl-α-
D-glucopyranoside và 1-O-methyl-β-D-glucopyranoside.
O HO HO OCH3 OH OH O HO HO OCH3 OH OH 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1-O-methyl-α-D-glucopyranoside 1-O-methyl-β-D-glucopyranoside (PEH1-a) (PEH1-b)
Từ dịch chiết cao hexane của rễ thu được hợp chất PEAC1. Cấu trúc của hợp chất này được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm và so sánh tài liệu tham khảo nên được đề nghị là 3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid. Đây là hợp chất mới trong tự nhiên. HOOC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24 11 12 13 14 26 27 18 15 16 17 19 20 21 22 28 25 29 30 HOOC
3,4-secofriedel-4(23)-en-3,29-dioic acid (PEAC1)
4.2 ĐỀ XUẤT
Trong phạm vi khóa luận, tôi chỉ mới khảo sát trên cao ethyl acetate của lá và cao hexane của rễ, nên trong thời gian tới nếu có điều kiện tôi sẽ khảo sát trên cao butanol và các bộ phận còn lại của cây me rừng với nhiều hi vọng cô lập thêm được những hợp chất có cấu trúc mới và sẽ tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các hợp chất cô lập được, mong muốn đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trịvào kho dược liệu Y học cổ truyền dân tộc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, NXB Y học, 695- 696.
Tài liệu Tiếng Anh
[2] Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus
Phyllanthus: Their Chemistry, Pharmacology, and Therapeutic Potential”,
Pharmacology, Medicinal Research Reviews, 18(4), 225-258.
[3] Chun-Bin Yang, Fan Zhang, Mei-Cai Deng, Guang-Yun He, Jian-Min Yue and Run-Hua Lu (2007), “A New Ellagitannin from the fruit of Phyllanthus emblica
L.”, Journal of the Chinese Chemical Society, 54, 1615-1618.
[4] F. Laure, G. Herbette, R. Faure, J.P. Bianchini, P. Raharivelomanana and B. Fogliani (2005), “Structures of new secofriedelane and friedelane acids from
Calophyllum inophyllum of French Polynesia”, Magnetic Resonance In Chemistry, 43, 65-68.
[5] Mahbuba Khatun, MiraJum Billah and Md. Abdul Quader’ (2012), “Sterols and Sterol Glucoside from Phyllanthus Species”, Dhaka University Journal of Science, 60(1), 5-10.
[6] Sitthichai Iamsaard, Supatcharee Arun, Jaturon Burawat, Wannisa Sukhorum, Porntip Boonruangsri, Malivalaya Namking, Nongnut Uanindut, Somsak Nualkaew and Bungorn Sripanidkulchai (2015), “Phyllanthus emblica L. branch extract ameliorates testicular damage in valproic acid – included rats”, Int. J. Morphol, 33(3), 1016 – 1022.
[7] Shashi B. Mahato, Asish P. Kundu (1994), “13C-NMR spectra of pentacylic triterpenoids- a complication and some salient features”, Phytochemistry, 37(6), 1517-1575.
[8] S. K. El-Desouky, Shi Young Ryu and Young-Kyoon Kim (2008), “A new cytotoxic acylated apigenin glucoside from Phyllanthus emblica L.”, Natural Product Research, 22(1), 91-95.
[9] Sharma Bhawna, Sharma Upendra Kumar (2010), “Hepatoprotective activity of some indigenous plants”, International Journal of PharmTech Research, 2(1), 568-572.
[10] Wei Luo, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao (2011), “Antioxidant and antiproliferative capacities of phenolics purified from
Phyllanthus emblica L. fruit”, Food Chemistry, 126, 277-282.
[11] Wei Luo, Lingrong Wen, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen, Guohua Rao (2012), “Structural identification of isomallotusinin and other phenolics in Phyllanthus emblica L. fruit hull”, Food Chemistry, 132, 1527-1533.
[12] Wei-Yan Qi, Ya Li, Lei Hua, Ke Wang, Kun Gao (2013), “Cytotoxicity and structure activity relationships of phytosterol from Phyllanthus emblica”,
Fitoterapia, 84, 252-256.
[13] Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang, Yueming Jiang (2008), “Identification of phenolics in the fruit of emblica (Phyllanthus emblica L.) and their antioxidant activities”, Food Chemistry, 109, 909-915.
[14] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, JinshuiWang and Weilou (2009), “Antimicrobial and antioxidant activity of emblica extracts obtained by supercritical carbon dioxide extraction and methanol extraction”, Journal of Food Biochemistry, 33, 307-330.
[15] Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Kegang Wu, Xianghua Chai, Hongpeng Yu, Zhihua