- Silica gel: silica gel 60, 0.04 – 0.06 mm, Merck dùng cho cột sắc kí. - Silica gel: silica gel 0.040-0.063 mm, Ấn Độ dùng cho cột sắc kí. - Silica gel pha đảo RP-18, Merck dùng cho sắc kí cột.
- Sắc ký lớp mỏng loại 25DC – Aflufolein 20×20, Kiesel gel 60F
254, Merck. - Sắc ký lớp mỏng loại 25DC, RP-18, Merck.
- Dung môi dùng cho quá trình cô lập các chất gồm: ethanol. hexane, ethyl acetate, nước cất, dichloromethane, chloroform, acetone, methanol, acetic acid. - Thuốc thửđể hiện hình các chất hữu cơ trên bảng mỏng: H2SO4 20%.
2.1.2. Thiết bị
- Máy cô quay chân không. - Đèn UV bước sóng 254 nm.
- Bếp cách thủy.
- Tủ sấy.
- Cân điện tử Sartorius Mass 620g.
- Các dụng cụ hỗ trợ cho việc chấm bảng, giải ly.
- Các dụng cụ chứa mẫu.
2.1.3. Phương pháp tiến hành
2.1.3.1. Phương pháp phân lập các loại hợp chất
Phương pháp sắc kí như SKC silica gel pha thường, pha đảo RP-18, và sắc kí lớp mỏng.
Hiện hình các chất hữu cơ trên bản mỏng bằng đèn UV với bước sóng 254 nm hoặc dung dịch H2SO4 20%.
2.1.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và 2D-NMR được ghi trên trên máy Bruker Avance tại Phòng thí nghiệm phân tích trung tâm, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Phường 4, Quận 5, TP. Hồ Chí Minh.
2.2. NGUYÊN LIỆU 2.2.1. Thu nguyên liệu
Mẫu được dùng trong nghiên cứu là lá cây me rừng được thu hái ở tỉnh Bình Thuận vào tháng 5 năm 2014.
Mẫu lá đã được TS.Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là Phyllanthus emblica L., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu được loại bỏ sâu bệnh, rửa sạch bằng nước và phơi khô. Sau đó đem đi xây thành bột mịn đểđiều chế cao.
2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO
Lá me rừng được phơi khô và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi là 7.2 kg. Nguyên liệu được ngâm dầm trong ethanol 96o, sau đó lọc và
cô quay phần dịch dưới áp suất thấp để thu hồi dung môi và thu được cao ethanol (285.5 g)
Cao ethanol thô được chiết lỏng – lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane (22.1 g), cao ethyl acetate (143.1 g) và cao còn lại (77.1 g). Quy trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.
Sơ đồ2.1 Quy trình điều chế cao hexane lá me và cao ethyl acetate lá me.
2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO HEXANE 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao hexane 2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao hexane
Cao hexane (22.1 g) được SKC với hệ dung môi giải ly H:EA có độ phân cực tăng dần (0-100% EA), tiếp theo giải ly với hệdung môi EA:Me có độ phân cực
Bột lá me rừng (7.2 kg)
- Ngâm trong ethanol 96o - Lọc
Bã khô Dịch ethanol
- Cô quay thu hồi dung môi
Ethanol thu hồi Cao ethanol (285.5 g)
- Chiết lỏng – lỏng với hexane, ethyl acetate - Cô quay thu hồi dung môi
Cao hexane (22.1 g)
Cao ethyl acetate (143.1 g)
Cao còn lại (77.1 g)
tăng dần (0-100% Me). Theo dõi SKLM, kết quả thu được 6 phân đoạn, kí hiệu từ H1 – H6 và được trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Sắc kí cột silicagel trên cao hexane.
STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghichú 1 H1 H 7.70 Vệt dài Chưa khảo sát 2 H2 H:EA 9:1 2.69 Nhiều vết Đã khảo sát 3 H3 H:EA 8:2 1.76 Nhiều vết Chưa khảo sát 4 H4 H:EA 7:3 0.54 Nhiều vết Chưa khảo sát
5 H5 H:EA 6:4 0.94 Nhiều vết Khảo sát
6 H6 EA 1.83 Nhiều vết Khảo sát
Ghi chú: H (hexane), EA (ethyl acetate)
2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn H5 (0.94 g) và H6 (1.83 g)
Phân đoạn H5 (0.94 g) cho SKLM nhiều vết nên được SKC silica gel với hệ dung môi DCM:Me với độ phân cực tăng dần (4-100% Me). Dựa vào SKLM, kết quảthu được 3 phân đoạn, kí hiệu từ H5.1 – H5.3. Kết quảđược trình bày ở bảng 2.2.
Dựa vào kết quả SKLM của phân đoạn H5.2 (426.9 mg), tiến hành SKC silica gel phân đoạn H5.2 nhiều lần với hệ dung môi C:EA:Ac:Me 8:0.5:0.5:0.2 thu được hợp chất không màu, dạng vô định hình, ký hiệu là PEA-N3 (7 mg).
Phân đoạn H6 (1.83 g) cho SKLM nhiều vết nên được SKC silica gel với hệ dung môi H:DCM với độ phân cực (50-100% DCM) và DCM:Me với độ phân cực tăng dần (0-100% Me). Theo dõi SKLM, những đoạn cho vết giống nhau được gom chung lại thành 1 đoạn, kết quảthu được 4 phân đoạn, kí hiệu từ H6.1
Trong các phân đoạn từ H6.1 – H6.4, phân đoạn H6.2 (253.1 mg) cho SKLM nhiều vết nên được SKC silica gel nhiều lần với hệ dung môi H:DCM 1:1 thu được hợp chất màu trắng, dạng bột, ký hiệu là PEHC (6 mg).
Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn (H5).
STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghichú
1 H5.1 DCM:Me 96:4 191.4 Vệt dài Chưa khảo sát
2 H5.2 DCM:Me 96:4 426.9 Nhiều vết, tách rõ Khảo sát thu được PEA-N3
3 H5.3 DCM:Me 5:5 104.8 Nhiều vết Chưa khảo sát Ghi chú: DCM (dichloromethane), Me (methanol)
Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn (H6).
STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghichú 1 H6.1 H:DCM 1:1 567.5 Vệt dài Chưa khảo sát
2 H6.2 H:DCM 1:1 253.1 Nhiều vết Khảo sát thu được PEHC
3 H6.3 DCM 302.6 Nhiều vết Chưa khảo sát 4 H6.4 DCM:Me 9:1 150.3 Vệt dài Chưa khảo sát
Ghi chú: H (hexane), DCM (dichloromethane), Me (methanol)
2.5. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 2.5.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate 2.5.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate
Cao ethyl acetate lá me (143.1g) được SKC silica gel lần lượt với các hệ dung môi rửa giải H:EA có độ phân cực tăng dần (80-100% EA) và EA:Me với độ phân cực tăng dần (5-100% Me). Theo dõi SKLM trên các phân đoạn, kết quả thu được 5 phân đoạn kí hiệu từ EA1 – EA5 (bảng 2.4).
Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate.
STT Phân đoạn Dung môi giải ly
Trọng
lượng (g)
Sắc kí lớp mỏng Ghichú
1 EA1 H:EA 2:8 16.50 Vệt dài Đã khảo sát 2 EA2 EA 13.28 Nhiều vết Chưa khảo sát 3 EA3 EA:Me 95:5 22.25 Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát
4 EA4 EA:Me 8:2 33.40 Nhiều vết Khảo sát
5 EA5 EA:Me 7:3 14.70 Nhiều vết Chưa khảo sát
Ghi chú: H (hexane), EA (ethyl acetate), Me (methanol)
2.5.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đạn EA4 (33.4 g)
Phân đoạn EA4 (33.4g) được SKC silica gel với các hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần (75-100% EA) và EA:Me có độ phân cực tăng dần (5-100% Me). Theo dõi qua SKLM, kết quảthu được 8 phân đoạn, được kí hiệu từ EA4.1
– EA4.8 và được trình bày ở bảng 2.5.
Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn (EA4).
STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (g) Sắc kí lớp mỏng Ghichú 1 EA4.1 H:EA 1:3 4.67 Vệt dài Khảo sát
2 EA4.2 H:EA 1:3 3.78 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát 3 EA4.3 H:EA 1:9 2.52 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát 4 EA4.4 H:EA 1:9 2.75 Vệt dài Chưa khảo sát 5 EA4.5 EA 1.59 Vệt dài Chưa khảo sát 6 EA4.6 EA:Me 95:5 1,86 Kéo vệt Chưa khảo sát 7 EA4.7 EA:Me 85:15 3.40 Có vết, tách rõ Đã khảo sát 8 EA4.8 EA:Me 6:4 2.80 Kéo vệt Chưa khảo sát
Ghi chú: EA (ethyl acetate), H (hexane), Me (methanol)
2.5.3. Sắc kí cột silicagel trên phân đoạn EA4.1 (4.67 g)
Phân đoạn EA4.1 (4.675 g) cho SKLM nhiều vết, vệt dài nên được SKC silica gel với bằng hệ dung môi rửa giải là DCM:Me với độ phân cực tăng dần (0-100%
Me). Kết quảthu được 7 phân đoạn, kí hiệu từ EA4.1.1 – EA4.1.7 và được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn (EA4.1).
STT Phân đoạn Dung môi giải ly Trọng lượng (mg) Sắc kí lớp mỏng Ghichú
1 EA4.1.1 DCM 352.4 Nhiều vết Chưa khảo sát
2 EA4.1.2 DCM:Me 95:5 308.0 Nhiều vết, tách rõ Khảo sát thu được PEA-N2
3 EA4.1.3 DCM:Me 9:1 923.6 Nhiều vết, kéo vệt Chưa khảo sát 4 EA4.1.4 DCM:Me 9:1 181.4 Kéo vệt Chưa khảo sát 5 EA4.1.5 DCM:Me 9:1 536.1 Kéo vệt Chưa khảo sát 6 EA4.1.6 DCM:Me 8:2 553.0 Nhiều vết Đã khảo sát 7 EA4.1.7 DCM:Me 7:3 412.1 Kéo vết Chưa khảo sát
Ghi chú: DCM (dichloromethane), Me (methanol)
Trong các phân đoạn từ EA4.1.1 – EA4.1.7 thì phân đoạn EA4.1.2 (308.0
mg) cho kết quả SKLM có nhiều vết, tách rõ nên được SKC silica gel pha đảo RP-18 nhiều lần với hệ dung môi Ac:H2O 2:3. Kết quảthu được hợp chất màu trắng, kết tinh trong acetone, ký hiệu là PEA-N2 (10 mg).
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEA-N2
Hợp chất PEA-N2 (10 mg) thu được từ phân đoạn EA4.1.2 có những đặc điểm sau:
- Màu trắng.
- SKLM với hệ dung môi giải ly hexane:acetone:acetic acid 3:2:0.02 cho một vết duy nhất, hiện hình bằng đèn UV cho vết màu tím, hiện hình với thuốc thử H2SO4 20% cho vết màu hồng. Phổ1 H-NMR (acetone-d6, phụ lục 1 và bảng 3.1), δH ppm: 7.052 (2H, s, H-2, H-6); 4.178 (2H, q, 7.0 Hz, H-8), 1.245 (3H, t, 7.0 Hz, H-9). Phổ13 C-NMR (acetone-d6, phụ lục 2 và bảng 3.1), δC ppm: 166.7 (>C=O, C- 7); các carbon của vòng thơm trong vùng 109.8-146.1 ; 60.9 (–C–O–, C-8); 14.7 (CH3, C-9).
Biện luận cấu trúc hợp chất PEA-N2
Phổ1
H-NMR của hợp chất PEA-N2 cho thấy tín hiệu cộng hưởng của proton vòng thơm δH 7.052 (2H, s), tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm –CH2CH3 ở δH 4.18 (2H, q, 7.0 Hz) và 1.25 (3H, t, 7.0 Hz).
Phổ 13
C-NMR của hợp chất PEA-N2 xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của carbon >C=O ở δC 166.7, các carbon vòng thơm trong vùng δC 146.1 – 109.8. Ngoài ra phổ đồ còn thể hiện tín hiệu cộng hưởng của carbon nhóm ethyl ở δC
60.9 và 14.7.
Từ những dữ liệu phổ NMR ở trên, cấu trúc của hợp chất PEA-N2 có thể được dựđoán gồm có 1 vòng thơm, 1 nhóm –CH2CH3, 1 nhóm –COO–.
Kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [27], cấu trúc hợp chất PEA-N2 được đề nghị là ethyl gallate. Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất PEA-N2. Vị trí PEA-N2 (acetone-d6) Ethyl gallate (DMSO) [27] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) 1 122.2 119.6 2,6 7.05 (s) 109.8 6.95 (s) 108.4 3,5 146.1 9.21 (s) 145.5 4 138.6 8.87 (s) 138.3 7 166.7 166.8 8 4.18 (q, 7.0) 60.9 4.27 (q, 7.1) 59.9 9 1.25 (t, 7.0) 14.7 1.34 (t, 7.1) 14.2 HO OH OH O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ethyl gallate (PEA-N2) 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEHC
Hợp chất PEHC thu được từphân đoạn H6.2 có những đặc điểm sau: - Dạng bột màu trắng.
- SKLM với hệ dung môi giải ly hexane:dichloromethane 1:1 cho một vết duy nhất, hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20% cho vết màu tím.
Phổ 1
H-NMR (DMSO-d6, phụ lục 3,4) δH ppm: 12.0, 5.16, 3.0 và những tín hiệu khác.
Phổ 1
C-NMR (DMSO-d6, phụ lục 5), δC 178.4, 143.9, 121.6, 76.9 và các độ dịch chuyển khác được trình bày trong bảng 9.
Biện luận cấu trúc hợp chất PEHC
Phổ 1
H-NMR của hợp chất PEHC xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của proton olefin ở δH 5.15 (1H, t, J=6.5) và proton của các nhóm methyl gắn trên carbon tứ cấp ở vùng từ trường cao (δH 1.09, 0.89, 0.87, 0.85, 0.71, 0.67 )
Phổ 1
C-NMR cho thấy hợp chất PEHC có 30 carbon. Trong đó có một carbon >C=O cộng hưởng ở δC 178.6, hai carbon olefin cộng hưởng ở δC 143.9 và 121.6, một carbon mang oxygen cộng hưởng tại δC 76.9. Các carbon methyl, methylen, methin và carbon tứ cấp cộng hưởng ở vùng từ trường cao. Từ những dữ liệu NMR cho phép dự đoán PEHC là một triterpenoid có nhóm –COOH có tín hiệu cộng hưởng của carbon olefin ở δC 143.9 và 121.6, cùng với tín hiệu của hai proton ở δH 2.99 (1H, dd, J=5 ), δH 2.73 (1H, dd, J=8.5), tín hiệu mũi đơn của bảy nhóm –CH3 ở vùng trường cao δH 1.09- 0.67 cho phép dự đoán
PEHC là một acid triterpenoid có khung sườn oleanan.
Từ đó, dữ liệu NMR của hợp chất PEHC được so sánh với dữ liệu NMR của oleanolic acid [6]. Kết quả so sánh có sự tương đồng nên hợp chất PEHC được đề nghị là 3β-hydroxyolean-12-en-28-oic acid, còn gọi là oleanolic acid.
HO O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 10 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 28 23 24 25 26 27 29 30
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ1 H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEHC Vị trí PEHC (DMSO- d6) Oleanolic acid (DMSO-d6) [6] δH (ppm) (J-Hz) δC (ppm) δC (ppm) 1 38.1 38.4 2 27.0 26.9 3 3.00 (ddd, 10.0/5.0/5.0) 76.9 79.0 4 38.5 38.8 5 54.9 55.1 6 18.1 17.9 7 32.5 32.7 8 39.0 39.2 9 47.2 47.0 10 36.7 37.8 11 22.7 23.2 12 5.16 (t, 3.0) 121.6 121.4 13 143.9 143.7 14 41.4 41.2 15 27.3 27.9 16 23.0 23.3 17 45.8 46.7 18 2.74 (dd, 13.5/4.0) 40.9 41.2 19 45.5 45.6 20 20.5 30.6 21 33.4 33.2 22 32.1 32.6 23 27.3 27.9 24 16.1 15.5 25 15.1 15.1 26 16.9 16.8 27 25.7 25.5 28 178.7 178.4 29 32.9 33.2 30 23.5 23.5 3.3 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEA-N3
Hợp chất PEA-N3 thu được từphân đoạn H5.2 có những đặc điểm sau: - Dạng bột vô định hình
- Không màu
- SKLM với hệ dung môi giải ly chloroform:ethyl acetate:acetone:methanol 8:0.5:0.5:0.2 cho một vết duy nhất, hiện hình bằng thuốc thử H2SO4 20% cho vết màu đỏ tím.
Phổ1
H-NMR (CDCl3, phụ lục 6, 7) δH ppm: 5.67 (>CH=C<) và các độ dịch chuyển khác được trình bày trong bảng 3.3.
Phổ 13
C-NMR (CDCl3, phụ lục 8, 9 và bảng 3.2) δC ppm: 174.8 (>C=O), 140.5 và 122.3, 101.4 (-O-CH-O-), 79.8 – 63.4 (-C-O-) và độ dịch chuyển của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.3.
Phổ HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 10 – 15).
Biện luận cấu trúc hợp chất PEA-N3
Phổ1
H-NMR cho thấy tín hiệu cộng hưởng của proton olefin ở δH 5.36 (m), proton gắn trên carbon mang oxygen δH 4.4 – 3.4, proton của các nhóm methyl, methylen, methine trong vùng từtrường cao δH 2.35 – 0,68.
Phổ 13
C-NMR thể hiện tín hiệu cộng hưởng của carbon >C=O tại δC 174.8, hai carbon olefin ở δC 140.5 và 122.3. Ngoài ra các tín hiệu cộng hưởng của carbon anomer (δC 101.4), carbon mang oxygen (δC 79.8 – 63.4) và các carbon methine, methylen, methyl ở vùng từtrường cao δC 56.9 – 12.01.
Phổ HSQC thể hiện tương quan giữa proton và carbon qua 1 liên kết giúp xác định các hydrogen gắn trên các carbon tương ứng. Theo đó proton cộng hưởng tại δH 5,36 tương quan với carbon có δC 122.3, các proton có δH 0.67, 0.82, 0.84, 0.84, 0.92, 1.005 có tương quan lần lượt với các carbon có δC 12.01 (C- 18), 19.5 (C-27), 19.1 (C-26), 12.1 (C-29), 18.9 (C-21), 19.9 (C-19) là những carbon của nhóm –CH3.
Ngoài ra, tín hiệu tương quan từ proton δH 5.36 đến hai carbon δC 128 và 130 trong phổ HSQC cùng với các tín hiệu của nhóm methyl cuối mạch của dây carbon dài (δC 14.2, δH 0.87, t) có thể cho phép dự đoán cấu trúc của PEA-N3 có chứa phần alkenoyl (CH3(CH2)mCH=CH-(CH2)n-CO-). Bên cạnh đó, tín hiệu của phần đường sáu carbon cũng được thể hiện trong các phổđồ NMR (δC
Qua các dữ liệu NMR trên có thể dự đoán cấu trúc của PEA-N3 là một steroid với khung sườn stigmastan, nối đôi tại vị trí C5-C6 và gắn thêm hợp phần alkenoyl và một phân tửđường. Tương quan HMBC từ proton cộng hưởng ởδH 1.85 (H-1) tới carbon cộng hưởng ởδC 79.7. Sự cộng hưởng của carbon C- 3 dịch chuyển về vùng từ trường yếu hơn khi so với C-3 mang nhóm –OH [7] nên có thể dựđoán nhóm –OH tại C-3 đã trở thành –OR.
Tuy nhiên phổđồ HMBC không thấy sựtương quan từ H-3 đến carbon trong gốc R, nên cấu trúc hợp chất PEA-N3 chưa xác định chính xác.
Kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [9], cấu trúc của PEA-N3 có thể tạm được đề nghị là dẫn xuất của β-sitosterol gắn một phân tửđường tại vị trí C-3, và trên phân tửđường tại vị trí C-6’ có gắn hợp phần alkenoyl.
O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 O HO HO O O HO 1' 2' 3' 4' 5' 6' R
Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất PEA-N3. Vị trí PEA-N3