Đối tượng: Tổng số 14 cá thể cá Chình thu mua tại một số vùng biển miền Trung Việt Nam bao gồm Lý Sơn (Quảng Ngãi), Trường Sa (Khánh Hoà). Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm tại Viện Hải dương học trong điều kiện bảo quản bằng đá lạnh với thời gian sớm nhất.
Tại phòng thí nghiệm, mẫu được rửa sạch, định danh khoa học, sau đó cá tách thành 02 phần (cơ, gan), bảo quản trong các túi plastic riêng ở điều kiện -20°C cho đến khi sử dụng thí nghiệm..
Thiết bị bảo quản mẫu: Tủ lạnh sâu MDF-549-PB (Panasonic, Nhật)
Bảng 2.1. Định danh và ký hiệu mẫu
Tên loài Kí hiệu mẫu Tên loài Kí hiệu mẫu
Cơ Gan Cơ Gan
Cá Lịch vân vòng C026 G026 Cá Lịch vân vòng C033 G033 Cá Lịch vân vòng C027 G027 Cá Lịch vân sóng C034 G034 Cá Lịch vân vòng C028 G028 Cá Lịch vân sóng C035 G035 Cá Lịch vân vòng C029 G029 Cá Lịch chấm tia C036 G036 Cá Lịch vân vòng C030 G030 Cá Lịch chấm tia C037 G037 Cá Lịch vân vòng C031 G031 Cá Lịch mõm trắng C038 G038 Cá Lịch vân vòng C032 G032 Cá Lịch mõm trắng C039 G039 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.2.1. Nguyên liệu, thiết bị
2.2.1.1. Dung môi, hóa chất
Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích dành cho LC/MS-MS.
- Methanol (Wako, code: 131-01826, độ tinh khiết: 99,8%)
- Acetone (Wako, code: 016-00346, độ tinh khiết: 99,5%)
- Hexan (Wako, code: 085-00416, độ tinh khiết: 96%)
- Acetone nitril (Wako, code: 014-00386, độ tinh khiết: 99,5%)
- Ethyl acetate (Wako, code: 051-00356, độ tinh khiết: 99,5%
- Amonium formate (Wako, code: 014-03125)
- Formic acid (Wako, code: 063-04192, độ tinh khiết: 99 %)
- Nước trao đổi ion (Hệ thống máy khử ion nước cất Ultral Clear GP UV UF TM, hãng sản xuất: Evoqua – Đức)
2.2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tíchThiết bị: Thiết bị:
- Máy sắc ký lỏng khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa phun điện (ESI) gồm máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng LC20AD-XR (Shimadzu, Nhật), bộ ổn nhiệt cột CTO-20A và bộ tiêm mẫu tự động SIL 20AC-XR kết nối thiết bị hệ phổ khối ba tứ cực MS/MS 8040 (Shimadzu, Nhật), hệ thống sử dụng khí nitơ từ bộ sinh khí AB-3G của Shimadzu.
- Máy ly tâm lạnh Mikko (Hermle, Đức, code: 58080029)
- Cân phân tích Sartorius CP224S (Sartorius, Thụy Sĩ) với d = 10-4 g.
- Thiết bị đồng nhất mẫu Ika T10 (Ika, Đức)
- Máy lắc xoáy, Ika Vortex 2 (Ika, Đức)
Ngoài ra, còn các thiết bị phụ trợ khác bao gồm nồi cách thủy, máy lọc nước trao đổi ion, hệ thống cô quay chân không, tủ âm sâu bảo quản mẫu… thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm cấp Viện Hàn lâm KHCNVN về “ATTP và môi trường (khu vực Miền Trung)” tại Viện Hải dương học.
Dụng cụ phân tích:
- Cột sắc ký pha đảo hiệu năng cao Agilent Poroshell 120 EC-C18 (100
× 2,1 mm, 1,9 mm kích cỡ hạt nhồi) (Agilent, Đức)
- Cột chiết ly pha rắn Florisil (InertSep FL-PR 500 mg, GL Science Inc.)
- Cột chiết ly pha rắn Florisil (InertSep FL-PR 200 mg, GL Science Inc.)
- Cột chiết ly pha rắn PSA (InertSep PSA, 200 mg, GL Sciences Inc.)
- Dụng cụ chính xác: Bộ micropipette (Eppendorf, Đức) thể tích 2-20, 10-100, 10-200, 100-1000 µL; pipet thủy tinh chính xác từ 1-10 mL.
- Ống ly tâm Teflon có nắp xoắn (15 và 50 mL), ống eppendorf (2 mL).
- Lọ đựng mẫu loại 1,8 mL, màu nâu dùng cho hệ tiêm mẫu LC tự động
- Các dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm như ống đong, cốc thủy tinh, phễu, giấy lọc…
2.2.2. Chiết tách và tinh sạch độc tố CTX từ cơ và gan của Chình biển
Trong quy trình tách chiết độc tố CTXs từ mẫu cá, ba yếu tố quan trọng chi phối độ chính xác của kết quả phân tích LC/MS-MS bao gồm dung môi tách chiết; làm sạch dịch chiết ban đầu và loại các tạp chất nhóm lipid.
a) Dung môi tách chiết
Do bản chất thân dầu của các độc tố CTXs ở dạng ester hóa, dung môi sử dụng để chiết các độc tố này ra khỏi thịt cá cần có độ phân cực phù hợp để đảm bảo hiệu suất chiết, đồng thời cũng phải hạn chế được việc chiết theo cùng các thành phần khác trong cá để đơn giản hóa giai đoạn làm sạch mẫu cũng như hạn chế sai số, nhất là dương tính giả và âm tính giả trong giai đoạn phân tích. Trong giai đoạn đầu sau khi CTXs được phát hiện và định danh, acetone (AcOH) được dùng để chiết độc tố từ cá để định lượng bằng thử nghiệm sinh học trên chuột [30]. MeOH và hỗn hợp MeOH - nước với các tỉ lệ nhất định cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu khác để chiết độc tố CTXs từ cá trước khi phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng với các đầu dò MS hay MS/MS [30], [1].
b) Phương pháp làm sạch dịch chiết ban đầu (clean-up)
Tùy thuộc vào dung môi chiết sử dụng trong giai đoạn đầu và loại kỹ thuật phân tích sẽ sử dụng, dịch chiết thô từ mẫu cá có thể được xử lý làm sạch theo nhiều quy trình khác nhau, nhưng về cơ bản là sử dụng 2 kỹ thuật chiết lỏng - lỏng và chiết ly pha rắn (solid phase extraction – SPE).
Chiết lỏng – lỏng
Đây là một kỹ thuật tách đơn giản nhất và trung thực nhất được sử dụng để làm sạch hoặc để tách một cấu tử riêng hoặc một loại các cấu tử khỏi mẫu mẹ. Mẫu rắn hoặc lỏng được chiết bằng dung môi hữu cơ thích hợp. Đối với các mẫu nước, dung môi chiết phải không tan trong nước. Độ phân cực của dung môi nằm trong một khoảng rộng từ các ankal như pentan, hexan, hoặc xiclohexan đến nitrobenzene và n-butanol, cũng như các dung môi có chứa clo (đặc biệt là dicloruametan, cloroform) thường có lợi thế tách chiết. Có hai quá trình chiết lỏng – lỏng là chiết không liên tục (chiết phân đoạn) và chiết liên tục.
Chiết ly pha rắn (Solid Phase Extraction – SPE)
Tuy nhiên, độc tố dạng thô thu được bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng chứa nhiều tạp chất có khối lượng phân tử tương đương với chất cần phát hiện. Thường hay bắt gặp hiện tượng các đỉnh MS không tách biệt, dính chồng nhau dẫn đến không thể xác định chính xác MW của mảnh ion. Do đó, bên cạnh chiết lỏng – lỏng, dịch chiết sơ bộ ban đầu từ thịt cá được tiếp tục làm giàu mẫu và làm sạch bằng phương pháp chiết ly pha rắn (SPE) trước khi phân tích bằng LC/MS-MS.
Chiết ly pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn; trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) – pha rắn. Pha rắn (pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được ankyl hoá nhóm -OH bằng các gốc hydrocarbon mạch thẳng (-C2, -C4, -C8, -C18…), hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính được nhồi vào cột chiết nhỏ
hoặc nén ở dạng đĩa dày 1-2 mm, đường kính 3-4 cm (đĩa chiết). Một số loại cột SPE pha thường thông dụng như Silica, NH2, CN, Diol, Florisil…; trong đó cột SPE 2,3 lớp của hỗn hợp các chất nền là tối ưu nhất để làm sạch dịch chiết độc tố CTXs. Dung môi giải hấp phụ thường là hỗn hợp CHCl-MeOH, hexan-MeOH, AcOH-MeOH hay EtOAc-MeOH với tỉ lệ thể tích nhất định hoặc Acetoniltril (MeCN).
c) Phương pháp loại tạp chất nhóm lipid trong dịch chiết
Với một số mẫu có hàm lượng chất béo cao (gan, ruột cá…), cần thực hiện bước thứ tiếp theo nhằm loại tạp chất béo. Trong trường hợp này, các cột pha đảo như Silica C18, C8, C4, NH2, CN, PHE, PSD, HLB thường được sử dụng dựa vào tương tác kỵ nước giữa pha rắn và mẫu. Hai loại sắc ký pha đảo cột nhồi thường được dùng là một loại pha tĩnh là chất mang (pha nền) silica gel gắn với các dây alkyl bằng liên kết hóa học (silica gel biến tính hóa học) và loại còn lại là các hạt nhựa nhồi cột. Ngoại trừ trường hợp đặc biệt, loại chất mang silica gel pha đảo thường được dùng vì khả năng tạo số lượng lớn đĩa lý thuyết. Phải sử dụng các hạt nhựa nhồi cột trong trường hợp pH của pha động dùng trong việc phân tách nằm ngoài khoảng cho phép để được sử dụng của silica gel hoặc nếu các nhóm silanol chưa được alkyl hóa nằm trên bề mặt của silica gel gây hiệu ứng bất lợi cho việc phân tách và vấn đề này không thể được giải quyết bằng cách thay đổi thành phần pha động. Dù vậy, đó là những trường hợp tương đối hiếm gặp. Các nhóm chức alkyl điển hình gắn trên silicagel bằng phương pháp hóa học gồm octadecyl, octyl và trimethyl. Mạch alkyl càng dài, lực lưu chất càng mạnh. Tuỳ lực lưu chất kỵ nước đối với hợp chất mục tiêu, cột có lực lưu chất yếu hơn được chọn nếu hợp chất cần phân tách không thể rửa giải trong một thời gian thích hợp ở điều kiện khi pha động cung cấp lực rửa giải mạnh nhất (dung môi hữu cơ 100%). Ngược lại, sử dụng cột có lực lưu chất mạnh hơn nếu chất cần phân tách không được lưu giữ trong một thời gian thích hợp ở điều kiện khi pha động cung cấp lực rửa giải yếu nhất (100% dung dịch đệm). Pha động cơ bản thường là một hỗn hợp gồm nước/dung dịch đệm và dung môi hữu cơ. Ba tác nhân chủ yếu ảnh hưởng đến sự phân tách là loại dung môi hữu cơ là tỉ phần dung môi hữu cơ
và độ pH của dung dịch đệm. Acetonitrile (MeCN) và MeOH là các dung môi hữu cơ được dùng phổ biến nhất. MeCN cung cấp lợi ích kép là có độ nhiễu thấp do độ hấp thu UV ở mức kém và tuổi thọ của cột được kéo dài, và cho phép việc phân tích diễn ra ở áp suất thấp. Tuy nhiên, MeOH có thể được dùng phổ biến hơn nhờ vào tính chọn lọc, thể hiện ở trường hợp tách được nhiều chất mà MeCN không tách được do sự khác biệt về hằng số phân ly của các chất trong 02 dung môi này. Mặt khác, tỉ phần của dung môi hữu cơ được chọn sao cho đạt được sự phân tách theo mong muốn và tốc độ rửa giải nhanh nhất, tăng tỉ phần của dung môi hữu cơ để tăng tốc độ rửa giải và ngược lại, giảm tỉ phần hữu cơ sẽ giảm tốc độ rửa giải nhưng sự phân tách diễn ra tốt hơn. Khi chỉ có các hợp chất trung hòa được phân tích, thời gian lưu không bị ảnh hưởng bởi pH của pha động, vì vậy việc phân tích thông thường được dùng bởi dung môi nước lẫn hữu cơ. Tuy nhiên, điều kiện về độ pH cũng phải được đáp ứng khi phân tích các acid và base.
Đối với độc tố CTXs, cột Sephadex LH-20, CIS packed column và LiChrosorb RP-18 hay được sử dụng để làm sạch dịch chiết ở bước này với dịch giải hấp phụ là MeOH-nước ở các tỉ lệ thể tích nhất định (6:4, 7:3, 8:2, 9:1…). Bước cuối cùng trong tinh sạch độc tố CTXs là sử dụng cột pha đảo chuỗi polymer ODS (InertSep C18, 200 mg).
* Thực nghiệm chiết tách và loại tạp dịch chiết độc tố CTX từ cơ và gan của Chình biển
Quy trình chiết tách được thực hiện theo Suzuki và cs., 2017 [1], mẫu được chiết trong dung môi Acetone với tỉ lệ w/v : 1/3.
- Cân mỗi mẫu khoảng 5 gam, đồng nhất và cho vào ống ly tâm nhựa, thêm 15 mL acetone, ngâm qua đêm.
- Ly tâm ở 3000 v/p trong 5 phút thu dịch trong, lặp lại 02 lần chiết với cùng thể tích acetone.
- Thu gom toàn bộ dung dịch acetone của 02 lần chiết. Khi acetone được sử dụng làm dung môi chiết ban đầu để tách độc tố nhóm CTXs ra khỏi mô cơ cá, dung môi này sẽ được bay hơi, thu được cặn.
- Hoà tan cặn trong 4 mL diethyl ether, lắc đều trong phễu chiết thuỷ tinh, để lắng cho đến khi dung dịch phân thành 02 lớp, thu lớp trên (diethyl ether) (công đoạn này thực hiện 2 lần).
- Bay hơi toàn bộ diethyl ether bằng hệ thống cô quay chân không để thu nhận cặn rắn. Hoà tan cặn này trong 1 mL MeOH-DW (tỷ lệ 9:1, v/v), thêm vào 2 mL hexane, để loại tạp lipid. Lắc đều trong phễu chiết thuỷ tinh, để lắng cho đến khi dung dịch phân 2 lớp, thu nhận lớp dưới (MeOH-DW). Cô quay chân không đuổi MeOH, thu được cặn thô chứa độc tố.
*Thực nghiệm khảo sát quy trình tinh sạch dịch chiết độc tố từ thịt cá
Việc sử dụng acetone làm dung môi chiết độc tố với thể tích và số lần chiết như đã trình bày ở phần trên cho phép chiết CTXs khỏi mô cá, tuy nhiên cần xem xét mức độ sạch của dịch chiết trước khi phân tích LC/MS-MS.
Để đánh giá sự cần thiết của giai đoạn làm sạch dịch chiết, quá trình chiết với acetone được tiến hành trên 6 mẫu cá (03 mẫu cơ, 03 mẫu gan). Mục đích của bước thử nghiệm này là để xác định điều kiện tối ưu trong chiết rút và tinh sạch độc tố.
Dịch chiết acetone trên mỗi mẫu được đánh giá độ sạch trong các điều kiện sau:
- Điều kiện 1: trộn đồng thể tích dịch chiết với ACN.
- Điều kiện 2: để dịch chiết ở 4°C trong 24h.
- Điều kiện 3: các mẫu xuất hiện vẩn đục ở điều kiện 1, ly tâm lấy dịch trong, thêm ACN kiểm tra, nếu còn vẩn đục, thêm ACN đến khi không còn xuất hiện vẩn đục, lại ly tâm lấy dịch trong bảo quản tiếp trong điều kiện 2.
-Điều kiện 4: các mẫu xuất hiện vẩn đục ở điều kiện 2, ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C, sau đó lấy dịch trong thêm ACN đồng thể tích, trộn đều.
- Điều kiện 5: pha loãng đồng thể tích dịch chiết với H2O, chiết với 5 mL isopropylacetat, lấy lớp isopropylacetat cô cạn, hòa cắn trong 5 ml AcOH rồi thêm 5 mL ACN trộn đều.
- Điều kiện 6: thực hiện như điều kiện 5, nhưng sau khi hòa cặn trong AcOH để dịch AcOH ở 4°C trong 24h.
- Điều kiện 7: cho dịch chiết qua cột chiết pha rắn Florisil (InertSep FL-PR 500 mg, GL Science Inc.), rửa cột bằng 1 ml H2O, rửa giải bằng 2 ml AcOH, trộn đồng thể tích dịch rửa giải với ACN.
- Điều kiện 8: tiến hành như điều kiện 7 trên cột chiết pha rắn Florisil (InertSep FL-PR 200 mg, GL Science Inc.).
-Điều kiện 9: tiến hành như điều kiện 7 trên cột chiết pha rắn Cột chiết pha rắn PSA (InertSep PSA, 200 mg, GL Sciences Inc.)
- Điều kiện 10: Tiến hành lần lượt cả điều kiện 7 và 8
- Điều kiện 11: Tiến hành lần lượt cả điều kiện 7, 8 và 9.
Từ kết quả khảo sát, đánh giá thực nghiệm, lựa chọn điều kiện làm sạch dịch chiết cho phép loại tốt các thành phần tạp bị chiết theo độc tố, đồng thờ i bảo toàn được lượng độc tố có trong dịch chiết ban đầu. Kết hợp điều kiện làm sạch dịch chiết với điều kiện chiết độc tố từ cá đã lựa chọn để thiết lập quy trình xử lý mẫu cá cho phân tích CTX-1B.
2.2.3. Xác định độc tố CTXs bằng phương pháp LC/MS-MS
Trong khuôn khổ luận văn này, điều kiện khối phổ đã được tối ưu hoá dựa vào quy trình của Yogi và cs. 2011 [30], có cải biến phù hợp độ nhạy chung của hệ sắc ký lỏng khối phổ tại phòng thí nghiệm Hoá sinh Biển, Viện Hải dương học, cụ thể:
- Ion sơ cấp lựa chọn là [M+Na]+ của CTX-1B có m/z 1133,6.
-Điều kiện sắc ký theo Yogi và cs., 2011, có các cải biến để giảm thiểu áp suất lên bơm LC, ion spray voltage (IS) là 5500V và nhiệt độ buồng ion IS là 500°C (TEM). Nguồn năng lượng ion GS1 và GS2 lần lượt là 80 và 30, giá trị tối ưu của DP (thể tách chùm) là 400, năng lượng bắn phá ion sơ cấp CE là 12V để đáp ứng cường độ peak tốt nhất trên đầu dò khối phổ MS.
- Sử dụng chế độ chạy SIM (Selected Ion Monitoring): Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo