4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.3.2. Hiệu quả ức chế của nano Đồng đến vi khuẩn Ralstonia
solanacearum
Đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum hiệu quả ức chế của nano đồng được thể hiện khá rõ rệt, ở nồng độ đồng càng cao thì đường kính vòng kháng càng lớn và hiện rõ (Hình 3.11 và Bảng 3.1).
Hình 0.13. Đĩa thạch thử tính kháng khuẩn của nano đồng đối với vi khuẩn
Bảng 0.5. Kích thước vòng kháng của nano đồng đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Nồng độ Nano Đồng (ppm) Đường kính trung bình vòng kháng (cm) 10 0,1 25 0,2 50 0,4 100 0,6 200 1
Có thể nhận thấy sau 24h thí nghiệm nano đồng đã thể hiện được tính kháng đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng việc xuất hiện các vòng kháng xung quanh lỗ thử. Ở nồng độ đồng là 10ppm đường kính vòng kháng chỉ là 0,1 cm tính nhưng khi ở đồng độ 100ppm đường kính vòng kháng đã tăng lên gấp 6 lần và cao nhất là 1cm ở nồng độ nano đồng 200ppm. Như vậy dung dịch nano đồng đã thể hiện được tính kháng khuẩn khá mạnh, ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, khi ở nồng độ đồng cao thì tính kháng thể hiện càng mạnh.
Khi chụp ảnh SEM, tế bào vi khuẩn bị phá hủy bởi dung dịch các hạt nano đồng (Hình 3.12). Đồng liên kết với các protein chuyên biệt và một số aminoacid tự do được công nhận là cơ chế để ngăn ngừa ảnh hưởng do oxy hóa [22]. Tuy nhiên, dưới áp lực oxy hóa, sự tích tụ của các loại oxy phản ứng, trong những điều kiện này các ion đồng liên kết có thể được giải phóng khỏi protein và trở thành hoạt động oxy hóa khử phá vỡ cấu trúc màng tế bào của vi khuẩn.
Hình 0.14. Hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Màng tế bào vi khuẩn bị vỡ với sự tồn tại của các hạt nano. Với tỷ lệ bề mặt trên thể tích lớn, các hạt ở quy mô nano dễ dàng tương tác với màng vi khuẩn. Hạt nano đó có thể được hấp thụ trên màng tế bào, dẫn đến khử cực. Sau đó, thành tế bào được thay đổi thành điện tích âm, trở nên dễ dàng bị phá vỡ, hạt nano đó có thể được hấp thụ trên màng tế bào, dẫn đến khử cực và trở nên dễ dàng bị phá vỡ. Nghiên cứu khác được báo cáo rõ ràng về cơ chế đồng tấn công màng tế bào. Cation đồng có thể tương tác với lipid gây ra quá trình oxy hóa trước và mở lỗ chân lông trong tế bào màng, dẫn đến ảnh hưởng đến tính nguyên vẹn của tế bào vi khuẩn. Đồng là một kim loại có ái lực lớn hơn với amino, photphat, nhóm cacboxyl và sulthydryl. Do đó, phospholipid có phản ứng với kim loại nhóm photphoryl và đôi khi là nhóm cacboxyl trong các vùng ưa nước của chúng có sẵn để liên kết các cation kim loại [42].
Dựa trên dựa trên kết quả phân tích hình thái của các hạt nano đồng ở trên, giả định rằng khi các hạt lớn (> 1 µm) xâm nhập vào tế bào, chúng giải phóng các hạt nhỏ hơn (<100 nm) tương tác và phá vỡ màng tế bào. Cấu trúc của hạt nano nhỏ có nhiều đầu nhọn các cạnh, có thể giúp tương tác với màng tế bào dễ dàng hơn. Cả hai vi khuẩn Xanthomonas axonopodis và Ralstonia
solanacearum là vi khuẩn gram âm nhưng chúng khác nhau về thành tế bào.
Xanthomonas axonopodis tường bao gồm một màng liposaccharid bên ngoài
và một bên trong là phospholipid màng [43]. Trong khi ở Ralstonia
solanacearum, nó chỉ lớp peptidoglycan nên dễ dàng bị phá vỡ hơn [44].
Qua kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của nano đồng thu được đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum và Xanthomonas axonopodis bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, nano đồng thể hiện khả năng kháng khuẩn với chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum. Vì thế, chủng vi khuẩn này tiếp tục được sử dụng trong thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng của nó trong môi trường có bổ sung nano đồng. Hình 3.13 cho thấy đường cong sinh trường của vi khuẩn trong môi trường có bổ sung nano đồng ở các mức nồng độ khác nhau. Ở mẫu đối chứng không bổ sung nano đồng, mật độ vi khuẩn tăng và đạt cực đại sau 24 giờ từ 0,061 đến 0,215 và giảm nhẹ xuống 0,207 sau 48h. Mẫu có nồng độ nano đồng 10 ppm và 25 ppm có đường cong sinh trưởng tương đồng và đều đạt cực đại sau 48h ở 0,278 và 0,262. Ở mẫu có nồng độ nano đồng 50 ppm, mật độ quang vi khuẩn giảm nhẹ sau 8 giờ từ 0,06 xuống 0,035 rồi lại tăng lên đạt 0,11 sau 2 ngày. Mật độ quang vi khuẩn ở nồng độ nano đồng cao 100 ppm chỉ tăng nhẹ từ 0,06 lên 0,08 sau 48 giờ và mật độ này gần như không thay đổi với mẫu nồng độ nano đồng 200 ppm (từ 0,032 lên 0,041). Ở các nồng độ nano đồng 50-100-200 ppm, vi khuẩn cho thấy sự sinh trưởng kém hơn mẫu đối chứng và mẫu nồng độ nano đồng 10-25 ppm.
Hình 0.15. Tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn Ralstonia solanacearum sau 48h Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của nano đồng thu được đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đó đường kính vùng ức chế có thể thấy nano đồng có khả năng diệt chủng vi khuẩn này. Chính vì vậy, đề tài tiếp tục xác định giá trị IC50 của nano đồng bằng phần mềm SciDAVis trên thuật toán Scaled lavenberg marquartr thu được các giá trị như sau:
Bảng 0.6. Bảng giá trị IC50
Thuật toán Giá trị
a y0 b x0 x R2
y= a+y0/(1+exp(- (x-x0)/b))
71,67 -1,24 7.31 35.9 42,6 0,98
Hiệu quả ức chế vi khuẩn được xác định thông qua giá trị IC50 bằng việc sử dụng thuật toán toán Unscaled lavenberg marquartr với phần mềm SciDAVis (bảng 3.2). Khả năng ức chế của nano đồng đối với chủng Ralstonia
solanacearum đạt IC50 = 42.6 ppm với hệ số tương quan đạt đến 0.98. Nano
đồng ở nồng độ cao hơn hoặc bằng 42.6 ppm có khả năng ức chế 50% mật độ chủng vi khuẩn trên. Theo Slavin và cộng sự thì sự phá hủy thành tế bào xảy ra từ tương tác vật lý giữa các nano kim loại và thành tế bào bất lợi hơn cho vi khuẩn gram âm vì chúng thiếu lớp peptidoglycan dày có trong màng vi khuẩn vì chúng có thể hoạt động như một lớp bảo vệ. Một lý do tiềm ẩn khác cho sự nhạy cảm với gram âm và khả năng tiếp xúc với nano kim loại là vi khuẩn gram âm được phủ với các phân tử lipopolysacarit, các phân tử tích điện âm này có ái lực cao hơn với các ion dương mà hầu hết các nano kim loại giải phóng, dẫn đến tích tụ và tăng hấp thu các ion, sau đó gây ra tổn thương nội bào [45]. Như vậy việc sử dụng nano đồng để kháng vi khuẩn gây bệnh đã được kiểm chứng do vi khuẩn nhạy cảm cao với độc tính của vật liệu nano chủ yếu liên quan đến màng tế bào được cấu tạo bởi lớp peptidoglycan mỏng (2-6 nm), đặc trưng của các vi khuẩn gram âm. Cả hai vi khuẩn Xanthomonas axonopodis và Ralstonia
solanacarum mặc dù là những vi khuẩn gram âm, nhưng do khác nhau về cấu
tạo thành tế bào riêng biệt nên nano đồng tác động nên chúng là khác nhau. Do vi khuẩn Ralstonia solanacarum có thành tế bào mỏng hơn, cấu trúc lỏng lẻo dễ bị phá vỡ hơn khi bị tác động của nano đồng so với vi khuẩn Xanthomonas
axonopdis, vì vậy Ralstonia solanacarum dễ dàng bị ức chế hơn. Như vậy, vật liệu nano đồng thu được từ nghiên cứu có thể ứng dụng như một loại thuốc trừ sâu sinh học an toàn và thân thiện với môi trường.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Nghiên cứu đã thiết kế, xây dựng được hệ thống điện sinh học không mạch ngoài đơn giản thích hợp cho việc tổng hợp vật liệu nano đồng.
So sánh được hiệu suất khử ion đồng và hiệu suất tạo vật liệu nano đồng trong hệ MFC với việc sử dụng hai chủng vi khuẩn Shewanella putrefaciens
SP200 và Shewanella sp HN41. Kết quả cho thấy, vai trò của cả hai chủng vi khuẩn trên trong hệ MFC đều có khả năng cao loại bỏ ion đồng có trong dung dịch và tạo nên vật liệu nano đồng. Hệ sử dụng chủng vi khuẩn HN41 có khả năng loại bỏ ion đồng và sản xuất nano đồng cao hơn gấp 2 lần so với hệ sử dụng chủng SP200.
Vật liệu tạo ở catot kết tủa dưới dạng các hạt hình cầu. Vật liệu nano đồng thu được dưới dạng tinh thể với kích thước hạt kết tụ 1,2 micro mét từ các hạt có kích thước 80 nm.
Cơ chất lactate trong khoang anot đều bị tiêu thụ hết sau 7 ngày thí nghiệm, pH trong khoang do sử dụng đệm HEPES nên được cân bằng ổn định ở pH 7,5.
Nano đồng tạo ra thể hiện tính kháng mạnh đối với vi khuẩn Ralstonia
solanacearum với đường kính vòng kháng 1cm khi nồng độ ion đồng là 200
ppm. Giá trị IC50 cho biết nồng độ Cu2+ là 42,6 mg/l. Vì vậy, việc sử dụng nano đồng nhằm thay thế cho các thuốc bảo vệ thực vật hóa học hiện nay rất hữu ích đối với ngành nông nghiệp nói chung và môi trường nói riêng.
2. Kiến nghị
Khả năng loại bỏ các ion đồng trong dung dịch còn thấp, cần cải tiến hệ thống để nâng cao khả năng loại bỏ ion đồng.
Vật liệu nano đồng thu được còn có hiện tượng kết tủa các hạt và kết tủa trên điện cực, do vậy cần được loại bỏ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Xia J.-B. and Cheah, K, 1997, Quantum confinement effect in thin
quantum wires, Physical Review B, 55(23): 15688.
2. Kar S and Chaughuri, S, 2006,Shape selective growth of CuS one-
dimensional nanostructures by a thermal evaporation process, The
Journal of Physical Chemistry B, 110(10): 4542-4547.
3. Ge J. and Li, Y, 2004, Selective atmospheric pressure chemical vapor
deposition route to CuS arrays, nanowires, and nanocombs, Advanced
Functional Materials, 14(2): 157-162.
4. Din MI, Rehan R, 2017, Synthesis, Characterization, and Applications of
Copper Nanopraticles. Anal Lett 50:50-62. Doi:
10.1080/00032719.2016.1172081
5. Nguyễn Hoàng Hải, 2007, Các hạt nano kim loại, Trung tâm Khoa học vật liệu, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
6. Trương Văn Tân, 2016, Vật liệu và thiết bị nano, Nhà xuất bản Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh.
7. Su L., Jia, W., Hou, C. and Lei, Y, 2011, Microbial biosensors: a review,
Biosensors and bioelectronics, 26(5): 1788-1799.
8. Haram S. K. Quinn, B. M. and Bard, A. J, 2001, Electrochemistry of CuS nanoparticles: a correlation between optical and electrochemiscal band
garp, Journal of the American Chemical Society, 20(28): 5899 – 5905.
9. Nông Minh Tuấn, 2006, Nghiên cứu phát triển thiết bị pin nhiên liệu vi sinh vật sử dụng cảm biến sinh học đánh giá chất lượng nước thải, Luận văn Tiến sĩ, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
11. Đỗ Thị Cẩm Vân, Cù Thị Thu Hà, 2018, Đánh giá khả năng ô nhiễm kim loại nặng (Pb, Cu) trong nước rỉ từ bùn thải nạo vét sông Kim Ngưu, Hà Nội, Tạp chí Khoa học Công nghệ, số 49.
12. Nguyễn Việt Hùng, Nguyễn Văn Nội, Nguyễn Đình Bảng, 2007, Nghiên cứu khả năng ứng dụng thực vật thủy sinh dùng cho xử lý nước thải ô
nhiễm kim loại nặng, Luận văn Tiến sĩ, Đại Học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
13. Phùng Ngọc Hải, 2019,Nghiên cứu đánh giá hàm lượng và phân bố dạng tồn tại của một số kim loại nặng trong nước và trầm tích trên hệ thống
sông nội đô Hà Nội, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà
Nội.
14. Hoàng Thùy Linh, 2018, Đánh giá hiện trạng ô nhiễm kim loại tại các hồ
Hà Nội và ảnh hưởng đến quần xã thủy sinh vật, Luận văn Thạc sĩ, Đại
học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội.
15. Bruce.E, Logan, 2007, Microbial Fuel Cells, Printed in the USA.
16. Logan, B. E., Hamelers, B., Rozendal, R., Schröder, U., Keller, J., Freguia, S., Rabaey, K., 2006, Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environmental Science & Technology, 40(17), 5181–5192. 17. Liu J., Olsson, G. and Mattiasson, B., 2004, Short-term BOD (BODst) as
a parameter for on-line monitoring of biological treatment process: Part I. A novel design of BOD biosensor for easy renewal of bio-receptor, Biosensors and Bioelectronics, 20(3): 562-570
18. Su L., Jia, W., Hou, C. and Lei, Y., 2011,Microbial biosensors: a review, Biosensors and bioelectronics, 26(5): 1788-1799
19. Wu K.-J., Chu, K.-C., Chao, C.-Y., Chen, Y.-F., Lai, C.-W., Kang, C.-C., Chen, C.-Y. and Chou, P.-T, 2007,CdS nanorods imbedded in liquid
crystal cells for smart optoelectronic devices, Nano Letters, 7(7): 1908-
20. Kim BH, Kim HJ, Hyun MS, Park DH., 1999, Direct electrodue reaction
of Fe(III) - reducing bacterium, Shewanella putrifaciens. J. Microbiol. ,
9:127 – 131.
21. Lower, SK., MF. Hochella, Jr., TJ. Beveridge, 2001, Bacterial recognition of mineral sufaces: nanoscale interactions betwween Shewanella and
anpha FeOOH. Science. 292(5520):pp.141-8.
22. Mathuriya A. S. and Yakhmi, J, 2014, Microbial fuel cells to recover
heavy metals, Environmental chemistry letters, 12(4): 483-494.
23. Thiều Quang Quốc Việt, Phạm Văn Toàn và Quách Ngọc Thịnh (2018). Tổng quan về pin nhiên liệu vi khuẩn: Lịch sử nghiên cứu, nguyên lý hoạt động và các cơ chế dịch chuyển điện tử giữa các màng sinh học vi khuẩn với các điện cực rắn, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ: 35-47. 24. Nguyễn Việt Anh, 2019, Xử lý, tái sử dụng nước thải, Nhà xuất bản Xây
dựng.
25. Lee J.-H., Han, J., Choi, H. and Hur, H.-G, 2007, Effects of temperature and dissolved oxygen on Se (IV) removal and Se (0) precipitation by
Shewanella sp. HN-41, Chemosphere, 68(10): 1898-1905
26. Choi, C., & Cui, Y, 2012, Recovery of silver from wastewater coupled
with power generation using a microbial fuel cell. Bioresource
Technology, 107, 522–525. doi:10.1016/j.biortech.2011.12.058
27. Wei, J., Liang, P., & Huang, X, 2011, Recent progress in electrodes for
microbial fuel cells. Bioresource Technology, 102(20), 9335–9344.
doi:10.1016/j.biortech.2011.07.019
28. Mehan V. K., Liao B. S., Tan Y. J and Hayward A. C, 1994, Bacterial wilt
of groundnut, No 35, ICRISAT, India, 23 pages
29. Kelman A, 1953, “The bacterial wilt caused by Pseudomonas
solanacearum, aliterary review and bibliography”. Technical Bulletin of
30. Đỗ Tấn Dũng, 2002, Bệnh héo rũ hại cây trồng cạn và biện pháp phòng
chống, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
31. Schaad, N. W, 1980, Identification schemes. I. Initial identification of common genera, p. 1-11. In N. W. Schaad (ed.), Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. American Phytopathological Society, St. Paul, Minn
32. Murakoshi R., Takahashi, M, 1984, “Trialt of some control of tomato
Bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum”, Bulletin of the
Kanagawa Horticultural Experiment Station, No 31, pp. 50 - 56.
33. Kim M., Hyun, M. S., Gadd, G. M. and Kim, H. J, 2007b, A novel
biomonitoring system using microbial fuel cells, Journal of environmental
monitoring, 9(12): 1323-1328.
34. Kim B. H., Chang, I. S. and Gadd, G. M, 2007a, Challenges in microbial
fuel cell development and operation, Applied microbiology and
biotechnology, 76(3): 485.
35. Tam, K., Ho, C. T., Lee, J.-H., Lai, M., Chang, C. H., Rheem, Y, Myung, N. V, 2010, Growth Mechanism of Amorphous Selenium Nanoparticles
Synthesized byShewanellasp. HN-41. Bioscience, Biotechnology, and
Biochemistry, 74(4), 696–700. doi:10.1271/bbb.90454
36. Kim B. H., Chang, I. S., Gil, G. C., Park, H. S. and Kim, H. J, 2003,Novel BOD (biological oxygen demand) sensor using mediator-less microbial
fuel cell, Biotechnology letters, 25(7): 541-545.
37. Nealson. KH, Scott.J, 2007, Emering infection: Shewanella – A series of
five cases, Joural of Laboratory Physicians.
38. Tao, H.-C., Liang, M., Li, W., Zhang, L.-J., Ni, J.-R., & Wu, W.-M, 2011,
Removal of copper from aqueous solution by electrodeposition in cathode
chamber of microbial fuel cell, Journal of Hazardous Materials, 189(1-2),
39. Geiser M, Rothen-Rutishauser B, Kapp N, Schürch S, Kreyling W, Schulz H, Semmler M, Im-Hof V, Heyder J, Gehr P, 2005, Ultrafine particles cross cellular membranes by nonphagocytic mechanisms in lungs and in
cultured cells, EnvironHealth Persp 113(11): 1555-1560.
40. Chithrani BD, Ghazani AA, ChanWC, 2006, Determining the size and
shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells,
Nano Lett 6(4): 662–668
41. Gao H, Shi W, Freund LB, 2005, Mechanics of receptormediated
endocytosis, Proc Natl Acad Sci USA 102(27): 9469–9474
42. Hong, R., Kang, T. Y., Michels, C. A., & Gadura, N., 2012, Membrane lipid peroxidation in copper alloy-mediated contact killing of Escherichia