Lựa chọn tốc độ dòng:
Tiến hành sắc ký với điều kiện sắc ký đã chọn với tốc độ dòng thay đổi 0,8 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,2 ml/phút, nhằm chọn tốc độ dòng thích hợp đảm bảo việc chất phân tách tốt và định lượng felodipin đồng thời rút ngắn thời gian phân tích, áp suất cột lại không quá cao.
Lựa chọn pha động:
Song song với việc lựa chọn tốc độ dòng, tiến hành nghiên cứu thành phần pha động dựa trên hỗn hợp gồm Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol. Khảo sát pha động với Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4
25 mM pH 3,0: Methanol các tỷ lệ thay đổi là: 40:40:20, 40:30:30, 30:30:40. Dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0 được chuẩn bị như sau: Hòa tan 1,7 g kali dihydrophosphat trong 400 ml nước, điều chỉnh pH đến 3,0 bằng dung dịch acid phosphoric và thêm nước vừa đủ 500 ml [1].
Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.4, 3.5, 3.6
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động
STT Tỷ lệ pha động ACN: đệm: MetOH Thời gian lưu tR(phút) 1 40:40:20 14,824 2 40:30:30 9,278 3 30:30:40 7,269 Hình 3.4. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 1
Hình 3.5. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 2
Hình 3.6. Sắc ký đồ của hệ pha động thứ 3
Nhận xét: từ kết quả ở bảng 3.2 thấy hệ dung môi Acetonitril: dung dịch đệm
KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol với tỷ lệ: 30:30:40 cho thời gian lưu hợp lý, pic cân đối, có hệ đối xứng nằm trong khoảng cho phép, thời gian lưu ngắn mà áp suất cột lại không cao.
Kết quả: lựa chọn pha động có tỷ lệ Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol với tỷ lệ: 30:30:40 (v/v/v) với tốc độ dòng 1,2 ml/phút. 3.1.4. Lựa chọn thể tích tiêm mẫu
Nhận xét: với thể tích tiêm mẫu là 20 µl cho pic đẹp, cân đối Kết luận: lựa chọn thể tích tiêm mẫu là 20µl
Kết luận: từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký lựa chọn là:
Cột sắc ký: Eclipse XDB C18 (4,6×150 mm, 5µm) Detector: UV bước sóng 362 nm
Pha động: Acetonitril: dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Methanol với tỷ lệ: 30:30:40 (v/v/v)
Thể tích tiêm: 20 µl Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng thí nghiệm
Dung dịch đệm KH2PO4 25 mM pH 3,0: Hòa tan 1,7 g kali dihydrophosphat trong 400 ml nước. Điều chỉnh pH đến 3,0 bằng dung dịch acid phosphoric và thêm nước vừa đủ 500 ml [1].
Hình 3.7 là sắc ký đồ của felodipin thu được ở điều kiện sắc ký thiết lập được
Hình 3.7. Sắc ký đồ của Felodipin (khảo sát điều kiện sắc ký)
3.2. Chuẩn bị mẫu
3.2.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
- Cân chính xác khoảng 25,0 mg Felodipin chuẩn vào bình định mức dung tích 25,0 ml, thêm khoảng 15,0 ml pha động, lắc cho tan, sau đó pha loãng bằng pha động đến vạch, lắc đều được dung dịch nồng độ 1 mg/ml.
Cho vào 5 bình định mức 50 ml các thể tích dung dịch felodipin nồng độ 1 mg/ml chính xác như bảng 3.3, pha loãng bằng pha động đến vạch, lắc đều.
Bảng 3.3. Cách pha các dung dịch chuẩn
STT Bình định mức (ml) Thể tích dung dịch chuẩn gốc (µl) Nồng độ dự kiến sau pha loãng (µg/ml) 1 50 500 10 2 50 600 12 3 50 800 16 4 50 1000 20 5 50 1200 24 Lọc qua màng 0,45 µm để chạy sắc ký. 3.2.2. Chuẩn bị dung dịch thử:
Cân chính xác khối lượng của 20 viên chế phẩm, tính khối lượng trung bìnhviên, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng khoảng 5,0 mg felodipin (viên có khối lượng trung bình 354,60 mg) cho vào bình định mức dung tích 50,0 ml, thêm khoảng 30 ml pha động, siêu âm 15 phút thêm pha động vừa đủ tới vạch, lắc đều. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 10,0 ml dịch sau ly tâm vào bình định mức 50,0 ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, được dung dịch thử.
3.2.3. Chuẩn bị mẫu trắng:
Là mẫu tá dược tự tạo bằng cách trộn theo nguyên tắc đồng lượng dựa vào công thức của viên, không chứa dược chất được cân và xử lý mẫu giống mẫu thử.
3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống
Tiến hành: chuẩn bị mẫu felodipin chuẩn nồng độ 20 µg/ml như mục 3.2.1. Sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch này theo điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
Stt Thời gian lưu (phút) Diện tích pic(mAU.s) Hệ số đối xứng Số đĩa lý thuyết 1 7,273 398,6 0,959 8411 2 7,154 396,2 0,994 8293 3 7,051 397,9 0,996 8102 4 7,280 396,6 0,988 8664 5 7,281 396,8 0,990 8602 6 7,175 399,0 0,997 8463 TB 7,203 397,5 8422,5 RSD% 1,29 0,29 Nhận xét:
Kết quả ở bảng cho thấy RSD của thời gian lưu và diện tích pic của Felodipin của 6 phép thử 2%,các giá trị đối xứng nằm trong khoảng cho phép 0,8 ≤ F≤ 1,5 và số đĩa lý thuyết trung bình cao.
Điều này chứng tỏ hệ thống sử dụng là phù hợp và đảm bảo ổn định cho phép phân tích định lượng felodipin.
3.3.2. Tính đặc hiệu
Chuẩn bị dung dịch chuẩn Felodipin nồng độ 20 µg/ml như mục 3.2.1, mẫu trắng như mục 3.2.3
Tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn với 3 mẫu chuẩn bị trên. Kết quả thu được các sắc ký đồ như ở hình 3.8, 3.9.
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu trắng
Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 20µg/ml
Nhận xét: ở hình 3.9 cho thấy pic của felodipin có tR= 7,303 phút, pic cân đối sắc nét
Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian phân tích từ 7- 8 phút. Chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao.
3.3.3. Độ tuyến tính
Tiến hành: chuẩn bị một dãy chuẩn felodipin có nồng độ 10-12-16-20-24 µg/ml như mục 3.2.1, sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị diện tích pic đo được ứng với các nồng độ của dung dịch trên và thiết lập phương trình hồi quy và hệ số tương quan r.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính Nồng độ C (µg/ml) 10,01 12,01 16,02 20,02 24,02 Diện tích pic (mAU.s) 174,4 211,2 292,4 376,7 455,8
Kết quả Phương trình hồi quy tuyến tính: y=20,237x - 30,125
Hệ số tương quan tuyến tính: R=0,9999
5 10 15 20 25 30 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát,
diện tích pic thu được đáp ứng trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của chúng,sự phụ thuộc thể hiện qua đường thẳng hồi quy tuyến tính (hình 3.10) và hệ số tương quan R= 0,9999. Như vậy phương pháp có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ khảo sát 10 - 24 µg/ml.
3.3.4. Độ chính xác
Chuẩn bị dung dịch thử như mục 3.2.2 làm 6 mẫu.Tiến hành sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và tính nồng độ felodipin trong các dung dịch thử theo đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn.
Kết quả xác định độ lặp lại của kết quả định lượng được trình bày ở bảng 3.6.
b. Độ chính xác trung gian
Phân tích định lượng felodipin trong viên ở ngày tiếp theo. Tiến hành tương tự như độ lặp lại trong ngày: phân tích 6 mẫu thử độc lập. Tính toán nồng độ chất thử theo đường chuẩn xây dựng được trong cùng ngày phân tích. Kết quả xác định hàm lượng felodipin trong viên được trình bày ở bảng 3.6
Bảng 3.6. Kết quả xác định độ chính xác STT Khối lượng cân (mg) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng so với lượng ghi trên nhãn (%) Các giá trị thống kê (%) Độ lặp lại 1 354,88 384,5 102,36 TB=101,98 RSD%=0,96 2 357,00 384,2 101,68 3 367,20 393,7 101,12 4 356,37 391,8 103,72 5 357,10 382,0 101,11 6 366,09 395,6 101,88 Độ chính xác trung gian 7 355,70 390,5 105,81 TB=106,08 RSD%=0,88 8 351,40 390,2 107,02 9 355,30 391,9 106,31 10 361,50 396,2 105,62 11 353,10 383,2 104,61 12 356,30 395,9 107,09 Gộp kết quả 2 ngày (n=12) RSD%=2,24
Với điều kiện đã chọn, độ lặp lại của các kết quả định lượng trong mỗi ngày phân tích cho RSD đạt được là 0,96% và 0,88% đều nhỏ hơn 2%. Đánh giá gộp kết quả 2 ngày cho RSD là 2,24 % nhỏ hơn 3%
Kết luận: phương pháp có độ lặp lại trong ngày và độ chính xác trung gian
đáp ứng yêu cầu thẩm định với chế phẩm thuốc. 3.3.5. Độ đúng:
Tiến hành:
- Pha dãy chuẩn: chuẩn bị như mục 3.2.1
- Mẫu tự tạo: Cân lượng mẫu tá dược tương đương khối lượng bột chứa 5 mg felodipin vào bình định mức 50,0 ml. Thêm chính xác khoảng 4 mg, 5 mg và 6 mg chất chuẩn felodipin vào bình, thêm 35 ml pha động. Siêu âm 15 phút, bổ sung bằng pha động tới vạch, lắc đều. Ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 10,0ml dịch sau ly tâm vào bình định mức 50,0 ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Sắc ký theo các điều kiện đã chọn ở trên, tìm độ thu hồi của chất chuẩn. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng Mức STT Khối lượng Nồng độ Felodipin Diện tích pic Lượng felodipi %tìm
nồng độ chuẩn thêm vào(mg) (µg/ml) (mAU.s) n tìm lại (mg) lại Mức 1 80% 1 4,01 16,06 297,1 4,04 100,66 2 3,97 15,87 291,3 3,97 100,07 3 4,04 16,16 299,4 4,07 100,76 Mức 2 100% 4 5,02 20,08 371,3 4,96 98,79 5 4,96 19,84 369,1 4,93 99,43 6 5,05 20,20 370,5 4,95 98,01 Mức 3 120% 7 6,02 24,096 454,4 5,99 99,36 8 5,95 23,81 452,5 5,96 100,17 9 6,06 24,24 454,7 5,99 98,83 Trung bình 99,56 RSD% 0,93
Nhận xét: Kết quả cho thấy độ đúng của phương pháp cho lượng chuẩn tìm lại
sau khi thêm lượng chuẩn đã biết đều nằm trong khoảng 98,0-102,0%. Độ lệch chuẩn tương đối là 0,93% 2%. Như vậy phương pháp có độ đúng cao.
Nhận xét chung: Phương pháp thẩm định có tính đặc hiệu cao, độ đúng, độ
chính xác cao và khoảng nồng độ tuyến tính có hệ số tương quan r là 0,9999 đáp ứng yêu cầu về thẩm định phương pháp phân tích. Phương pháp có thể ứng dụng định lượng felodipin trong các chế phẩm thuốc.
3.4. Ứng dụng định tính và định lượng Felodipin trong chế phẩm
Trên cơ sở điều kiện sắc ký đã xây dựng tiến hành định tính, định lượng trong viên felodipin 5 mg giải phóng có kiểm soát - sản phẩm nghiên cứu của Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội.
Tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch thử như mục 3.2.2,
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25,0 mg Felodipin chuẩn vào bình định mức dung tích 25,0 ml, thêm khoảng 15 ml pha động, lắc cho tan, sau đó pha loãng bằng pha động đến vạch, lắc đều được dung dịch
nồng độ 1 mg/ml. Lấy 1,00 ml dung dịch nồng độ 1 mg/ml vào bình định mức 50,0 ml, thêm pha động tới vạch được dung dịch chuẩn nồng độ 20 µg/ml. Chạy sắc ký các mẫu theo điều kiện đã chọn, ghi pic đáp ứng. Mỗi mẫu thử tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Hàm lượng felodipin so với lượng ghi trên nhãn được tính theo công thức: % hàm lượng = mC× H × (1-a) ×××100
Trong đó:
St, Sc (mAu.s): diện tích tương ứng của dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Ft, Fc: hệ số pha loãng tương ứng của dung dịch thử và chuẩn.
Vt, Vc: thể tích của dung dịch thử và chuẩn trước khi pha loãng (ml). a (%): phần trăm hàm ẩm của felodipin chuẩn.
H: hàm lượng của felodipin chuẩn (%). mtb: khối lượng trung bình viên (mg).
mt, mC: khối lượng bột tương ứng của chế phẩm thử và chuẩn (mg). b: hàm lượng ghi trên nhãn của viên (mg).
Kết quả: cân lượng chuẩn mC = 24,80 mg cho Spic = 364,05. Kết quả định tính và định lượng được trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.11, 3.12.
Bảng 3.8. Kết quả định lượng Felodipin trong viên giải phóng có kiểm soát
STT Lượng ghi trên nhãn (mg) Khối lượng cân chế phẩm thử (mg) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng (%) 1 5 355,3 391,9 106,87 2 5 355,7 390,5 106,37 3 5 356,3 395,9 107,66 TB ± SD 106,97±0,65
Hình 3.11. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn
Hình 3.12. Sắc ký đồ của mẫu định lượng
Nhận xét: từ hình 3.11 và 3.12 thấy thời gian lưu của mẫu thử tương ứng với
thời gian lưu của mẫu chuẩn chứng tỏ pic trên sắc ký đồ mẫu định lượng là của felodipin.
Kết quả ở bảng cho thấy chế phẩm viên nén felodipin giải phóng có kiểm soát đạt quy định về hàm lượng theo qui định về hàm lượng Dược điển Việt Nam IV về chế phẩm viên nén có hàm lượng hoạt chất 5 mg là 90,0 – 110,0 % so với lượng ghi nhãn.
3.5. BÀN LUẬN
HPLC là phương pháp hiện đại được áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm của nhiều nước trên thế giới cũng như tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam bởi những ưu điểm nổi trội của nó về độ ổn định, độ chính xác cao, định lượng được nhiều chất không cần phân tách trước tại nhiều bước sóng khác nhau. Phương pháp chúng tôi đưa ra sử dụng phương pháp HPLC góp phần bước đầu tiêu chuẩn hóa cho chế phẩm viên nén felodipin 5 mg giải phóng có kiểm soát mà Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận riêng nào.
Quy trình phân tích chúng tôi đã xây dựng để định lượng Felodipin cho kết quả tốt, tính khả thi cao. Phương pháp đã được thẩm định đầy đủ về tính đặc hiệu, độ phù hợp, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao (thời gian lưu là khoảng 7,3 phút), độ lặp lại tốt (RSD = 0,96%), độ chính xác trung gian cao (RSD = 0,88%), khoảng tuyến tính từ 10 µg/ml đến 24 µg/ml, độ đúng cao (độ tìm lại nằm trong khoảng 98,00% đến 100,76%, RSD=0,93%).
So sánh với phương pháp HPLC định lượng felodipin trong viên nén của P. Santhosh Kumar phương pháp chúng tôi xây dựng cũng dùng cột C18 khá phổ biến, nhưng loại cột ngắn, dung môi sử dụng làm pha động kinh tế hơn, thời gian phân tích ngắn hơn. Còn so với phương pháp của Fusun Gedil thì phương pháp tuy sử dụng dung môi đắt tiền hơn nhưng loại cột ngắn hơn, không sử dụng chất chuẩn nội, thời gian phân tích ngắn mà vẫn đảm bảo các tiêu chí thẩm định nên kinh tế hơn rất nhiều.
So với phương pháp hóa học và phương pháp quang phổ UV- VIS phương pháp chúng tôi xây dựng sử dụng thiết bị HPLC phức tạp hơn nhưng hệ thống này đã được sử dụng phổ biến ở niều nơi mà độ nhạy, độ ổn định và độ chính xác cao hơn cả về mặt định tính và định lượng.
Như vậy, phương pháp này khá đơn giản, sử dụng dung môi acetonitril, methanol là những dung môi phổ biến, hay dùng cho HPLC, chương trình chạy sắc ký đẳng dòng thích hợp cho đơn vị máy HPLC không có khả năng chạy gradient dung môi. Phương pháp có thể áp dụng định tính felodipin dựa vào thời gian lưu, định lượng felodipin trong viên dựa vào diện tích pic thu được, thử độ đồng đều hàm lượng trong viên chứa felodipin đồng thời dựa vào khoảng tuyến tính ta có thể dùng phương pháp này thử độ hòa tan với chế phẩm viên nén felodipin giải phóng kéo dài đang phổ biến trên thị trường hiện nay.
Tóm lại, phương pháp phân tích xây dựng được có độ đặc hiệu và độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính phù hợp, độ đúng đảm bảo lại dễ dàng ứng dụng tại các phòng thí nghiệm, các cơ sở sản xuất…sử dụng máy HPLC với thời gian phân tích khoảng 9 phút.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết luận
Từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi đạt được mục tiêu đề ra là