o Ở thí nghiệm này, ta dùng cồn để chiết là để hạn chế sự thuỷ phân Saponin cũng như hoà tan một số tạp chất khác có thể làm sai Saponin cũng như hoà tan một số tạp chất khác có thể làm sai lệch kết quả thí nghiệm. Sau đó tiếp tục chiết với CHCl3 để chiết Sapogenin.
o Phản ứng đặc hiệu lên màu với các dẫn chất có nhân Steroid, cơ chế của phản ứng là sự khử nước của acid mạnh. chế của phản ứng là sự khử nước của acid mạnh.
o Ta kết luận Saponin trong Cam Thảo là Saponin Triterpenoid.
c) Định tính Saponin trong Cam Thảo bằng sắc ký lớp mỏng - Chuẩn bị thí nghiệm: - Chuẩn bị thí nghiệm:
o Nguyên liệu, dung môi, hoá chất: ▪ Bột cam thảo ▪ Bột cam thảo
Tiểu Luận PRO(123docz.net,0343252360) ▪ MeOH ▪ MeOH
o Dụng cụ:
▪ Bảng mỏng được tráng sẵn Silicagel ▪ Cốc thuỷ tinh, bến đun, bình sắc ký ▪ Các dụng cụ phòng thí nghiệm khác
- Tiến hành thí nghiệm:
o Cân 0.5g bột Cam Thảo thêm vào 5ml Methanol, đun cách thuỷ trong 15 phút trong 15 phút
o Lọc, cô đặc dịch lọc.
o Cắt bảng mỏng thành hình chữ nhật có kích thước 1cm x 10 cm, kẻ thêm vạch xuất phát ở cuối bảng. kẻ thêm vạch xuất phát ở cuối bảng.
o Cho hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O vào bình sắc ký, sau cho chiều cao mực dung môi ko vượt quá vạch xuất phát. cho chiều cao mực dung môi ko vượt quá vạch xuất phát.
o Dùng mao quản chấm dịch chiết vào bảng mỏng, đợi MeOH bay hết, cho vào bình sắc ký đã chuẩn bị. bay hết, cho vào bình sắc ký đã chuẩn bị.
o Đợi dung môi trong bình chạy hết bảng mỏng, tiến hành đánh dấu các vết trên bảng mỏng. dấu các vết trên bảng mỏng.
o Đo độ dài từ vạch xuất phát đến vết, từ vạch xuất phát đến hết bảng (độ dài từ vạch xuất phát đến dung môi). bảng (độ dài từ vạch xuất phát đến dung môi).
Tính Rf theo công thức:Rf = độ dài cℎất đi được
độ dài dung môi cℎạy được
- Giải thích hiện tượng và kết luận:
o Mỗi chất sẽ có hình dạng vết và Rf khác nhau. Nên ta có thể dựa vào chúng để xác định thành phần các chất có trong dung dịch vào chúng để xác định thành phần các chất có trong dung dịch
o Qua tính toán và so sánh, ta có thể xác định trong Cam Thảo có chứa Saponin. có chứa Saponin.
2. Định lượng Saponin trong cây Cam Thảo
a) Định lượng Saponin bằng phương pháp cân
Đây là phương pháp truyền thống để định lượng Saponin. Người ta tiến hành định lượng bằng cách chiết tách Saponin ra khỏi Cam Thảo sau đó cân Saponin. Phương pháp này cho độ chính xác không cao.
b) Định lượng Saponin bằng phương pháp đo quang
- Đối với Saponin trong Cam Thảo, người ta thường sử dụng thuốc thử là Vanillin-Sulfuric với dung môi Methanol.
- Tiến hành chiết Cam Thảo bằng Methanol
- Cho lần lượt thuốc thử Vanillin-Sulfuric biết trước nồng độ vào máy đo quang UV-Vis với bước song từ 400nm-700nm. Dựng đường chuẩn từ nồng độ và độ hấp thu quang.
Tiểu Luận PRO(123docz.net,0343252360)
- Cho dịch chiết Cam Thảo vào máy đo quang đo độ hấp thu. Dựa vào độ hấp thu và đường chuẩn ta xác định được nồng độ Saponin trong Cam Thảo
c) Định lượng Saponin bằng sắc ký lỏng cao áp
Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong định tính, định lượng các chất nói chung và saponin nói riêng. Người ta có thể thực hiện định tính 1 thành phần hay đồng thời nhiều thành phần trong hỗn hợp.
Pha tĩnh cho sắc ký lỏng cao áp với các saponin thường là pha đảo PR- 18. Pha tĩnh theo cơ chế rây phân tử cũng có thể được dùng.
Hệ dung môi sử dụng trong sắc ký là hỗn hợp nước – methanol – acetonitril với các tỉ lệ khác nhau, có hay không có dung dịch đệm. Chương trình dung môi có thể là isocratic hay gradient.
Detector dùng để phát hiện gồm xác định chỉ sổ khúc xạ (RI), hay tán xạ bay hơi (ELSD), detector có nhiều ưu điểm nhất hiện nay là detector khối phổ (MS hay MS/MS với kỹ thuật ion hóa ESI hay APCI). Do các saponin ít cso các nối đôi, nhất là nối đôi liên hợp nên thường chỉ có hấp thu tử ngoại ở vùng sóng ngắn 210 -195 nm nên việc sử dụng detector UV tương đối hạn chế trong phân tích saponin.