3 40 40 X X T (ml) 1,6 3,2 20 LM (ml) 3 3 3 X X T (ml) 1,6 3,2 15 LM (ml) 0,5 0,5 0,5 X T (ml) 1,6 3,2 10 LM (ml) 0,5 0,5 0,5 X T (ml) 0,8 1,6 5 LM (ml) 0,5 0,5 0,5 X T (ml) 0,4 0,8 Ngày 1 LM (ml) 3 3 3 X X Di n gi i Đ!i ch ng Nhóm 1 Nhóm 2 ELISA CTBC
T: tiêm vaccine LM: l y máu ml: lư ng máu ñư c l y ho9c th tích vaccine CTBC: công th c b ch c u
Hình 3.2: L y máu ñ ng m ch
3.4.2. L5p công th3c b@ch c)u
- L y 1 gi t máu nh) lên m t ñ u c a lame A. Dùng ngón cái và ngón tr) c a tay trái c m lame A; ngón cái và ngón tr) c a tay ph i c m lame B (ch n lame B có c nh th t nhUn). G t nh% c nh c a lame B ti p xúc v i m9t trên c a lame A . sát phía trư c gi t máu m t góc 30 – 45o. Kéo lame B lui l i cho ch m gi t máu, khi máu ñã tan ra trên c nh lame B thì ñ+y nh% và liên t(c lame B trên m9t lame A cho v t ph t lan ñ#u. V t ph t kính t!t ph i m)ng và ñ#u.
- Đ v t ph t khô t" nhiên trong không khí và c! ñnh v t ph t b ng c n methanol. Sau khi c n khô nhúng v t ph t vào dung d ch eosin trong vòng 10 giây r i l y ra ñ khô t" nhiên. Ti p t(c nhúng v t ph t vào dung d ch xanh methylen trong vòng 1 phút, sau ñó l y ra r*a nư c li#n và ñ tiêu b n khô trong không khí.
- Sau khi tiêu b n nhu m ñã khô. Đ tiêu b n lên kính hi n vi, ñi#u ch$nh kính và ánh sáng cho v'a ph i, quan sát toàn b tiêu b n . v t kính 10. Nh) m t gi t d u cedar lên m t góc c a v t ph t máu và xoay qua v t kính 100. Chuy n d ch tiêu b n theo hình zít zát, quan sát và ñ m t'ng lo i b ch c u. T'ñó l p công th c b ch c u.
3.4.3.Thu nh5n huy t thanh và kháng th$
Đ t 1 máu ñư c l y vào các ngày 1, 30 và 55 ñ xét nghi m ELISA.
Đ t 2 máu ñư c l y vào các ngày 1, 5, 10, 15, 20 và 30 ñ l p công th c b ch c u, các ngày 1, 20 và 30 l y huy t thanh ñ xét nghi m ELISA. Riêng ngày 30, lư ng máu l y nhi#u nh t (40 ml) vì huy t thanh ñư c ñem ñi tinh chi t kháng th .
Cách l y máu: -Trư c khi l y máu tráng !ng b ng nư c mu!i sinh lí 0,9%. -C! ñnh th), c o s ch lông và sát trùng vùng mu!n l y máu. L y máu . ñ ng m ch gi&a tai.
-Sau khi l y máu xong dùng que c y kh* trùng vét xung quanh !ng. -Cho sodium azide (NaN3) vào !ng.
Vsodium azide = 0,05% Vmáu (V: th tích) -B o qu n 24h . 4oC.
-Sau khi b o qu n qua ñêm máu ñư c tách thành 2 l p, ñem ly tâm v i v n t!c 3000 vòng / phút. L y ph n huy t thanh nIi phía trên và b) ph n c9n phía dư i.
-Huy t thanh (HT) ñư c l y 1ml ñ xét nghi m ELISA. Riêng ngày 30 c a ñ t 2, huy t thanh ñư c chia thành hai ph n: ph n 1 (1 ml) ñem ñi xét nghi m ELISA và ph n 2
ñư c s* d(ng ñ tinh chi t kháng th .
Sơ ñA 3.1: X* lý huy t thanh
3.4.3.1. Tách kháng th$ b;ng ammonium sulphate bão hòa
-Cho vào m i chai ñ"ng huy t thanh m t lư ng PBS 1X g p ba l n lư ng huy t thanh.
-T a huy t thanh th) b ng dung d ch ammonium sulphate 100 %. Th tích ammonium sulphate 100 % b ng tIng th tích huy t thanh và PBS.
-Huy t thanh th) và PBS 1X ñư c ñ trong nư c ñá bào trên máy khu y t'.
-Nh) t'ng gi t (NH4)2SO4 100 % vào dung d ch huy t thanh và PBS 1X, sau khi nh) xong ñ thêm kho ng 45 – 60 phút.
-B o qu n qua ñêm . nhi t ñ 4 oC. -Li tâm tách k t t a.
-R*a t a 3 l n b ng dung d ch (NH4)2SO4 45 %.
-Cho vào !ng 50 ml, gi& t a trong ammonium sulphate 45 % . 4 oC. HT
ELISA HT k t t a,
Hình 3.3: Th"c hi n th+m tích
3.4.3.2. Thu hAi kháng th$
Kháng th t a trong ammonium sulphate 45 % ñư c thu h i b ng phương pháp th+m tích.
-Chu+n b bao th+m tích
Bao th+m tích ñư c c,t ra và r*a qua nư c c t, sau ñó cho vào c!c nư c c t ch a 2 mM EDTA. Đun 3 gi r i r*a l i b ng nư c c t cho s ch EDTA. Cho vào bình ch a c n 30 oC, b o qu n . 4 oC.
-Th"c hi n th+m tích
Cho kháng th t a trong ammonium sulphate 45% vào bao th+m tích, dùng k%p k%p 2 ñ u bao th+m tích l i và ñ9t bao th+m
tích vào dung d ch PBS 4 – 5 gi . 4 oC. Th"c hi n 4 l n th+m tích như trên sau ñó thu kháng th ñ xác ñnh hi u giá. TIng lư ng dung d ch ñ m là 6 lít.
3.4.3.3. Phương pháp ELISA phát hi n kháng th$
Các m u huy t thanh ñư c mang ñ n Trung Tâm Thú Y Vùng thành ph! H Chí Minh ñ xét nghi m ELISA.
Hi n nay, Trung Tâm Thú Y Vùng s* d(ng b kít ELISA (Ceditest) phát hi n kháng th kháng protein E2 do vi n nghiên c u Thú Y Hà Lan s n xu t.
B kít này phát hi n kháng th kháng protein E2 (gp55) c a virus DTH theo cơ ch c nh tranh tr"c ti p v i kháng th ñơn dòng th hai (mAb 2) có g,n men HRPO. Kháng th ñơn dòng th nh t (mAb 1) ñư c ph lên ñáy gi ng ñóng vai trò là kháng th b y kháng nguyên. Kháng nguyên dùng trong ph n ng này là protein E2 (gp55) ñư c s n xu t theo phương pháp tái tI h p v i Baculovirus nuôi trên môi trư ng t bào côn trùng.
Hình 3.3: Xét nghi m ELISA
(http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1/ ch5_elisa.jpg) Lư ng kháng th kháng protein E2 ñư c tính toán d"a vào ph n trăm c ch (PI – percent inhibition) theo công th c sau:
PI = 100 - × 100 Ý nghĩa c a ph n trăm c ch
PI < 30 % không có kháng th trong m u th*
PI = 31 % - 50 % không k t lu n (nghi ng có kháng th trong m u th*) PI > 50 % có kháng th trong m u th*
3.5.CHB TIÊU THEO DÕI
Ph n trăm các lo i b ch c u trong công th c b ch c u c a máu K t qu xét nghi m ELISA c a huy t thanh và d ch chi t
3.6.X LÝ S LI U
Tính trung bình và vS bi u ñ b ng ph n m#m Microsoft Excel.
S* d(ng tr,c nghi m F m t y u t!. ph n m#m Minitab for Windows 12.21. OD450 m u th*
Chương 4
K T QU VÀ TH O LU N 4.1.ĐÁP *NG CCA TH KHI TIÊM VACCINE
4.1.1. Đ:t 1
Trong ñ t này, m(c tiêu là xem xét kh năng ñáp ng c a th) khi tiêm vaccine v i kho ng cách dài ngày, và l y huy t thanh ki m tra hàm lư ng kháng th b ng xét nghi m ELISA. TIng s! m u huy t thanh xét nghi m là 8 m u, sau khi ki m tra t t c 8 m u ñ#u âm tính. B&ng 4.1: K t qu ELISA ñ t 1 Th) Ngày Th) 1 Th) 2 Th) 3 1 - - - 30 - - - 55 - - Ch t -: âm tính
Trong ñ t 1, kho ng cách gi&a hai l n tiêm vaccine là 30 ngày; th i ñi m l y máu sau mũi m n c m là 30 ngày ho9c sau mũi nh,c l i là 25 ngày. Hàm lư ng kháng th có th ñ t ñư c ñ$nh ñi m vào ngày th 14 sau khi tiêm kháng nguyên (d n li u Nguy n Vân Anh, 2005). Tuy nhiên Trung Tâm Thú Y Vùng s* d(ng b kít ELISA dùng trên heo, do
ñó khi s* d(ng trên th) thì ñ nh y có th th p nên k t qu thu ñư c t'ñ t 1 là âm tính. Ngoài ra, li#u vaccine có th nh hư.ng ñ n ñáp ng mi n d ch c a th) .
4.1.2. Đ:t 2
Trong ñ t này, xem xét kh năng ñáp ng c a th) v i vaccine ñư c ñánh giá thông qua công th c b ch c u và xét nghi m ELISA. Trư c khi xét nghi m huy t thanh b ng ELISA m u máu ñư c l y ñnh kì ñ l p công th c b ch c u. Do s! lư ng hai lo i b ch
c u ưa acid và b ch c u ưa bazơ r t ít, ch$ có t- l c a b ch c u trung tính, b ch c u ñơn nhân l n và lâm ba c u ñư c xem xét.
Bi u ñ 4.1 cho th y không có s" thay ñIi l n trong t- l c a 3 lo i b ch c u trung tính, lâm ba c u và ñơn nhân . th)ñ!i ch ng. Ngo i tr' s! lư ng b ch c u ñơn nhân cao
. l n l y máu ñ u tiên, có th do th) ñang m,c b nh nh% . ñư ng hô h p, sau khi bình ph(c s! lư ng b ch c u ñơn nhân ñã In ñnh tr. l i. Ngoài ra t- l b ch c u trung tính cũng tăng nh% t' ngày th 5 ñ n ngày th 20, có th ñây là giai ño n th) chu+n b lành b nh. Tuy nhiên th)ñ!i ch ng ch$ g m 1 con nên s! li u ch$ mang tính tham kh o.
B&ng 4.2: T- l % b ch c u trung tính, ñơn nhân và lâm ba c u c a th)ñ!i ch ng B chc u
Ngày BC trung tính Lâm ba c u BC ñơn nhân
1 5 71 21 5 7 85 8 10 12 81 6 15 13 79 7 20 12 78 8 30 6 87 7
B&ng 4.3: T- l % b ch c u trung tính, ñơn nhân và lâm ba c u c a m i th) nhóm 1
BC trung tính (%) Lâm ba c u (%) BC ñơn nhân (%)
Ngày
I1 I2 I3 ( ± SE) TB I1 I2 I3 ( ± SE) TB I1 I2 I3 ( ± SE) TB 1 22 20 22 21,33 ± 0,67 66 68 68 67,33 ± 0,67 6 7 6 6,33 ± 0,33 5 50 25 39 38 ± 7,23 38 65 58 53,67 ± 8,09 9 8 2 6,33 ± 2,19 10 9 15 23 15,67 ± 4,06 80 78 76 78 ± 1,15 10 6 1 5,67 ± 2,6 15 22 5 41 22,7 ± 10,4 69 80 54 67,67 ± 7,54 8 15 5 9,33 ± 2,96 20 13 25 24 20,67 ± 3,84 78 70 71 73 ± 2,52 8 5 4 5,67 ± 1,2 30 5 3 9 5,67 ± 1,76 86 92 85 87,67 ± 2,19 9 3 6 6 ± 1,73
I1: th) 1 c a nhóm 1; I2: th) 2 c a nhóm 1; I3: th) 3 c a nhóm 1 MC: m n c m; NL: nh,c l i; TB: trung bình
B&ng 4.4: T- l % b ch c u trung tính, ñơn nhân và lâm ba c u c a m i th) nhóm 2
BC trung tính (%) Lâm ba c u (%) BC ñơn nhân (%)
Ngày
II1 II2 II3 TB
( ± SE) II1 II2 II3
TB
( ± SE) II1 II2 II3
TB ( ± SE) 1 19 24 20 21 ± 1,53 66 58 69 64,3 ± 3,28 10 17 10 12,33 ± 2,33 5 24 46 26 32 ± 7,02 66 49 56 57 ± 4,93 9 4 16 9,67 ± 3,48 10 18 25 9 17,33 ± 4,63 79 70 80 76,33 ± 3,18 2 4 11 5,67 ± 2,73 15 17 28 20 21,67 ± 3,28 80 68 76 74,67 ± 3,53 2 2 4 2,67 ± 0,67 20 14 36 11 20,33 ± 7,88 74 42 76 64 ± 11 11 18 13 14 ± 2,08 30 3 19 3 8,33 ± 5,33 93 78 88 86,33 ± 4,41 3 1 8 4 ± 2,08
II1: th) 1 c a nhóm 2; II2: th) 2 c a nhóm 2; II3: th) 3 c a nhóm 2 MC: m n c m; NL: nh,c l i; TB: trung bình
Hai bi u ñ 4.2 và 4.3 trình bày tIng quát s" bi n ñIi c a các lo i b ch c u trung tính, b ch c u ñơn nhân và lâm ba c u.
Đ!i v i b ch c u trung tính, t- l b ch c u này tăng lên cao vào ngày th 5 (sau mũi m n c m). S" bi n ñIi ti p theo c a b ch c u này là: gi m m nh vào ngày th 10 (sau mũi nh,c l i l n 1), tăng nh% vào ngày th 15 (sau mũi nh,c l i l n 2) r i gi m d n
ñ n ngày th 30.
Đ!i v i b ch c u ñơn nhân l n, biên ñ dao ñ ng nh&ng ñư ng bi u di n c a nhóm 1 không th t s" rõ như. nhóm 2. Ngoài ra . nhóm 1 tăng nh% vào ngày th 15 (sau mũi nh,c l i l n 2), . nhóm 2 tăng cao vào ngày th 20 (sau mũi nh,c l i l n 3).
Đ!i v i lâm ba c u, t- l c a lâm ba c u ngư c l i so v i t- l b ch c u trung tính. Khi b ch c u trung tính tăng thì lâm ba c u gi m, khi b ch c u trung tính gi m thì lâm ba c u tăng. T- l c a b ch c u này tăng cao nh t vào ngày th 30 (sau mũi nh,c l i l n 4).
M9c dù s" thay ñIi t- l các lo i b ch c u . hai nhóm không gi!ng nhau hoàn toàn, nhưng có ñi m chung sau: giai ño n ñ u t- l b ch c u trung tính tăng, giai ño n ti p theo t- l b ch c u ñơn nhân tăng, và giai ño n cu!i t- l b ch c u lympho tăng. S"
bi n ñIi c a các lo i b ch c u cho th y ñã xu t hi n ti n trình phòng v c a cơ th th)ñ!i v i s" xâm nh p c a virus vaccine d ch t , k t qu này phù h p v i d n li u c a Tr n Th Dân và Dương Nguyên Khang (2006). Ngoài ra s" bi n ñ ng này không khác bi t th!ng k (P > 0,05) gi&a hai nhóm th) khi tiêm li#u vaccine khác nhau.
V i nh&ng thay ñIi nêu trên, th) c a c hai nhóm có lS ñã ñáp ng v i vaccine d ch t heo. Tuy nhiên ñây ch$ m i là k t qu ban ñ u, mu!n bi t chính xác th) có th t s" ñáp ng mi n d ch hay không thì c n ki m tra kháng th . K t qu xét nghi m ELISA
B&ng 4.5: K t qu ELISA ñ t 2
Th) nhóm 1 Th) nhóm 2
Th)
Th i ñi m ĐC I1 I2 I3 II1 II2 II3
1 - - - -
20 - + - Nghi
ng - + +
30 - + - + - + +
Sau khi chi t xu t + - + - + +
ĐC: ñ!i ch ng -: âm tính +: dương tính
Th) I2 và II1 tuy ñư c tiêm 4 l n v i nh&ng li#u vaccine khác nhau và tăng d n nhưng v n cho k t qu âm tính . t t c các l n th* ELISA, nói cách khác 2 th) này ñã không ñáp ng mi n d ch khi ñư c tiêm vaccine. Th) I3 m9c dù có k t qu ELISA nghi ng vào ngày 20 (có th có kháng th trong m u) nhưng ñ n ngày 30 ñã cho k t qu dương tính. Nhìn chung, s" chuy n dương c a huy t thanh bi n ñ ng theo cá th th).
4.2.PH N TRĂM *C CH (PI) CCA HUY T THANH NGUYÊN VÀ SAU KHI THDM TÍCH
Theo nghiên c u c a Wensvoort và ctv (1988) v# m!i quan h gi&a phương pháp ELISA v i phương pháp NPLA (neutralisation peroxidase – linked assay) trong vi c phát hi n kháng th ch!ng virus d ch t heo trong huy t thanh, có phương trình tương quan h i quy: Y = - 69,6344 + 11,828X – 0,1791X2 (r = 0,93). Trong ñó Y là ph n trăm c ch (PI) xét nghi m b ng phương pháp ELISA và X là k t qu hi u giá kháng th xét nghi m b ng phương pháp NPLA. Như v y gi&a PI và hi u giá kháng th có m!i tương quan v i nhau, do ñó PI ñư c dùng ñ so sánh lư ng kháng th có trong huy t thanh c a các m u dương tính t' b ng 4.5.
B&ng 4.6: K t qu PI c a huy t thanh nguyên khi ELISA (*) Th) Th i ñi m Ph n tr(PI) ăm c ch I1 83 I3 36 II2 87 II3 20 86 I1 93 I3 66 II2 95