Qua nghiên cứu này, sự tác động của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và phát sinh hình thái mẫu phôi sâm Lang Bian được biểu hiện rõ rệt qua các chỉ tiêu: phát sinh phôi thứ cấp, chồi, khối lượng tươi, khối lượng khô. Trong đó chỉ tiêu về tỉ lệ mẫu tạo phôi, lượng phôi hình thành trên mỗi mẫu nuôi cấy được thể hiện qua bảng 1.
Sau 30 ngày nuôi cấy nhận thấy mẫu nuôi cấy có cảm ứng tạo phôi, các chỉ tiêu về tỉ lệ mẫu cảm ứng phát sinh phôi và số lượng phôi trên mỗi mẫu nuôi cấy được thu nhận. Dưới sự tác động của môi trường, mẫu cấy đã có sự kích ứng tạo phôi và làm gia tăng số lượng phôi trên mỗi mẫu nuôi cấy từ môi trường B5, 1/2 MS, SH, MS đến WPM (hình 2a). Trong đó, mẫu phôi nuôi cấy trên môi trường WPM cho số lượng phôi trên mẫu là cao nhất (7,17 phôi/mẫu) ở thời điểm 30 ngày nuôi cấy, với tỉ lệ mẫu phát sinh phôi là 56,00%. Tỉ lệ phát sinh phôi trên môi trường MS và 1/2 MS là 73,33%, nhưng số lượng phôi hình thành trên hai môi trường nuôi cấy lại không cao chỉ khoảng 5,50 và 4,50 phôi/mẫu. Mẫu phôi nuôi cấy trên môi trường SH và B5 cũng cho thấy sự cảm ứng tạo phôi với tỉ lệ mẫu tạo phôi lần lượt là 46,67% và 53,33%. Ứng với số lượng phôi hình thành trên mỗi mẫu nuôi cấy là 5,33 và 2,83 phôi/mẫu (bảng 1). Kết quả này cho thấy mẫu nuôi cấy trên các môi trường khoáng khác nhau có sự cảm ứng và tăng trưởng phôi là khác nhau. Các phôi hình thành trên mẫu có đặc điểm như phôi thường hình thành quanh đầu phôi mẫu, phôi có màu trắng hơi vàng dạng phôi cầu đơn, cụm phôi cầu và phôi hình tim, một số ít ở dạng phôi mầm.
20 Bảng 1. Tác động của môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh phôi trên mẫu
phôi sâm Lang Bian Giai đoạn sinh trưởng Môi trường nuôi cấy Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%) Số phôi/mẫu Đặc điểm
SH 46,67c 5,33h Ít phôi, phôi có dạng hình cầu là
chủ yếu.
MS 73,33b 5,50h Ít phôi, phôi dạng cầu là chủ yếu,
hình mầm.
30 ngày 1/2 MS 73,33b 4,50h Phôi chủ yếu ở dạng hình cầu, số ít
dạng hình tim.
WPM 56,00c 7,17g Phôi dạng hình cầu, hình tim, hình
mầm.
B5 53,33c 2,83i Ít phôi, phôi có dạng hình cầu là
chủ yếu.
SH 93,33a 13,50e Phôi dạng hình cầu, hình tim, hình
mầm.
MS 93,33a 14,50e Phôi dạng hình cầu là chủ yếu, số
ít hình mầm.
60 ngày 1/2 MS 91,67a 10,50f Phôi dạng hình cầu là chủ yếu,
hình mầm.
WPM 90,33a 9,17f Phôi dạng hình cầu là chủ yếu,
hình mầm.
B5 94,67a 14,00e Phôi dạng hình cầu là chủ yếu,
dạng hình mầm.
SH 100a 19,50d Phôi dạng hình cầu, hình tim, hình
mầm. Hình thành quanh đỉnh mẫu.
MS 100a 35,33b Phôi dạng hình cầu, hình mầm.
Hình thành quanh đỉnh mẫu phôi.
90 ngày 1/2 MS 100a 44,33a Phôi dạng hình cầu, hình đuôi cá,
phôi hoàn chỉnh.
WPM 100a 29,17c Phôi dạng hình cầu, hình mầm,
phôi hoàn chỉnh.
B5 100a 19,17d Phôi dạng hình cầu, hình mầm.
Hình thành quanh đỉnh mẫu phôi.
CV% 0,14 0,07
Ghi chú: Những chữ cái khác nhau (a, b…) được nêu trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α = 0,05
21 Hình 2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng phát sinh hình thái phôi sâm Lang Bian. a: Cụm phôi dạng cầu, mầm hình thành sau 90 ngày nuôi cấy; b: phôi dạng hình tim; c-d: phôi mầm và cụm phôi mầm; e: phôi trưởng thành ở thời điểm 90 ngày nuôi cấy; f: hình ảnh các “nốt phôi” hình thành trên phôi mẫu.
Ở thời điểm 60 ngày nuôi cấy, tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo phôi, số lượng phôi trên mẫu được hình thành ở các môi trường khoáng tiếp tục gia tăng (bảng 1). Tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo phôi cao trên môi trường SH, MS (93.33%), tỉ lệ mẫu cấy tạo phôi trên hai môi trường có sự tăng trưởng mạnh từ 46,67% và 73,33% lên đến 93,33%. Trên môi trường B5 cũng nhận thấy có sự gia tăng về tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo phôi cao nhất là 94,67% và không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê khi tỉ lệ mẫu tạo phôi ở hai môi trường 1/2 MS, WPM là 91,67% và 90,33%. Phôi thứ cấp hình thành tại thời điểm này cũng có sự gia tăng về số lượng trên mỗi môi trường nuôi cấy. Trên
a b c
22 môi trường SH, MS và B5 số lượng phôi hình thành trên mẫu là cao (bảng 1). Trong đó, phôi trên môi trường MS có khả năng tạo phôi cao nhất (14,50 phôi/mẫu). Số lượng phôi hình thành trên môi trường 1/2 MS và WPM cũng không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê, nhưng môi trường có số lượng phôi hình thành thấp nhất thời điểm này lại là môi trường WPM (9,17 phôi/mẫu). Điều này cho thấy mẫu cấy trên môi trường WPM có khả năng cảm ứng tạo phôi chậm hơn các môi trường còn lại sau 60 ngày nuôi cấy. Các phôi này thường ở dạng phôi cầu đơn, cụm phôi cầu, dạng hình tim, đôi khi là dạng thủy lôi (hình 2).
Đến thời điểm 90 ngày mẫu cấy trên tất cả các môi trường khoáng đều đạt 100% tỉ lệ mẫu tạo phôi. Số lượng phôi thứ cấp hình thành trên mẫu cũng tăng ở thời điểm này, trong đó môi trường 1/2 MS có số lượng phôi cao nhất là 44,33 phôi/mẫu, kế đó là môi trường MS (35,33 phôi/mẫu). Số lượng phôi hình thành trên các môi trường giảm dần từ môi trường khoáng WPM, SH đến B5, thấp nhất là B5 với 19,17 phôi/mẫu. Các phôi này có dạng hình cầu, hình tim, phôi trưởng thành, hình mầm, đôi khi có hình thành khối mô sẹo từ cụm phôi.
Như vậy, qua từng thời điểm nuôi cấy mẫu phôi có thể thấy tỉ lệ mẫu cảm ứng và số lượng mẫu phát sinh hình thái phôi khác nhau trên mỗi môi trường nuôi cấy. Trong đó, tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo phôi trên mỗi môi trường khoáng có sự tăng trưởng khác biệt theo từng thời điểm nuôi cấy. Ở thời điểm 30 ngày, môi trường MS. 1/2 MS có khả năng cảm ứng tạo phôi cao (73,33%), trên các môi trường còn lại mẫu chỉ cảm ứng tạo phôi từ 46,67% đến 56,00%. Đến thời điểm 60 ngày, tỉ lệ mẫu tạo phôi trên môi trường SH có tốc độ tăng trưởng cao từ 46,67% lên đến 93,33%. Nhưng khả năng cảm ứng tạo phôi cao nhất lúc này lại là môi trường B5 (từ 53,33% lên đến 94,67%). Tỉ lệ mẫu tạo phôi trên môi trường WPM không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê so với môi trường B5. Các môi trường 1/2 MS, MS có sự tăng trưởng chậm ở thời điểm này (73,33% lên 91,67% và 93,33%). Qua 90 ngày nuôi cấy tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo phôi của mẫu cấy trên các môi trường đều đạt 100%. Dựa trên số liệu bảng 1 có thể đưa ra khẳng định, khi nuôi cấy mẫu sâm Lang Bian, tốc độ tăng trưởng về tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo phôi trên mỗi môi trường khoáng có sự thay đổi theo từng thời điểm nuôi cấy, sự khác biệt này có lẽ là do thành phần dinh
23 dưỡng khác nhau trong môi trường đã tác động làm thay đổi khả năng sinh trưởng của mẫu cấy.
Số lượng phôi tạo thành trên mẫu nuôi cấy ở mỗi môi trường cũng một trong những yếu tố cho thấy môi trường khoáng có tác động đến sự phát sinh phôi. Ở thời điểm 30 ngày mẫu có cảm ứng tốt nhất trên môi trường WPM với số phôi hình thành trên mẫu nuôi cấy là 7,17 phôi/mẫu, số lượng phôi/mẫu thấp nhất trên môi trường B5 với 2,83 phôi/mẫu. Các phôi này chủ yếu là phôi dạng cầu, hình thành ở đầu mẫu phôi và được xem là phôi thứ cấp. Đến thời điểm 60 ngày, phôi thứ cấp có sự tăng trưởng về số lượng trên các môi trường khoáng. Phôi này có dạng cầu, cụm phôi cầu nhỏ, dạng hình tim, một số hình thủy lôi có khả năng phát triển thành phôi trưởng thành. Phôi hình thành nhiều trên môi trường MS (14,50 phôi/mẫu) và thấp nhất trên môi trường WPM (9,17 phôi/mẫu). Ở ngày nuôi cấy thứ 90 môi trường 1/2 MS có số lượng phôi cao nhất là 44,33 phôi/mẫu, môi trường có số lượng phôi thấp là môi trường B5 với 19,17 phôi/mẫu. Các phôi này có dạng hình cầu, hình tim, phôi trưởng thành và có xuất hiện số ít khối mô sẹo từ cụm phôi. Kết quả tương tự cũng được công bố trong nghiên cứu của Mai Trường và ctv (2014) về tạo và nhân phôi soma sâm Ngọc Linh, mẫu phôi sau nuôi cấy có hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi và các ‘nốt’ mô nhỏ dạng cầu ở đầu phôi mẫu, từ đó tạo phôi cầu đơn hoặc cụm phôi cầu, chúng bắt đầu tăng trưởng tạo ra các hình thái phôi khác nhau như dạng hình tim, dạng thủy lôi hay phôi hoàn chỉnh với cấu trúc lưỡng cực có cực chồi và cực rễ phát triển. Trong nghiên cứu của Bùi Văn Thế Vinh và ctv (2014), về hình thái giải phẫu và cấu trúc phôi trong quá trình phát sinh phôi vô tính sâm Ngọc Linh cũng cho phôi vô tính được hình thành từ các khối tiền phôi, các tế bào có khả năng phát sinh phôi trải qua quá trình phân chia tạo phôi vô tính. Phôi này có dạng cầu gồm các tế bào nhỏ giàu tế bào chất bao quanh bởi một lớp tế bào nguyên bì. Phôi phát triển lớn dần, nhờ hoạt động phân chia tế bào liên tục mà hình thành phôi hình tim sớm. Đến giai đoạn hình tim muộn, diễn ra sự kéo dài trục phôi tạo cấu trúc lưỡng cực, phôi tiếp tục tăng trưởng chiều cao của các mầm lá mầm bao quanh trục phôi tạo phôi hình thủy lôi. Phôi thủy lôi tiếp tục tăng trưởng thành phôi trưởng thành với cực chồi và cực rễ phát triển rõ, từ đó tạo cây con hoàn
24 lưỡng cực hình thành từ những tế bào sinh dưỡng mà không có sự kết nối hệ thống mạch dẫn với mô mẹ. Phôi phải trải qua các hình thái khác nhau mới có thể tạo nên cây con hoàn chỉnh.
Hình 3. Các giai đoạn sinh trưởng mẫu phôi trên sâm Lang Bian. a-b: Ảnh hưởng của môi trường khoáng sau 30 ngày, 60 ngày nuôi cấy đến hướng phát sinh hình thái của mẫu phôi sâm Lang Bian; c-d: Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sự sinh trưởng của mẫu phôi sâm Lang Bian sau 90 ngày nuôi cấy.
Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường khoáng có ảnh hưởng
đến khả năng phát sinh hình thái chồi của mẫu phôi sâm Lang Bian nuôi cấy in vitro
qua từng thời điểm khác nhau (bảng 2). Tỉ lệ mẫu tạo chồi và số lượng chồi hình thành có sự khác biệt khi mẫu được nuôi cấy trong môi trường khoáng khác nhau. Ở thời điểm 30 ngày, trên môi trường 1/2 MS và WPM có xuất hiện cảm ứng tạo chồi, các môi trường còn lại chưa thấy chồi có sự hình thành chồi trên mẫu nuôi cấy. Trong đó, tỉ lệ mẫu tạo chồi trên hai môi trường lần lượt là 26,67% và 49,00%, với
d SH MS 1/2MS WPM B5 SH MS 1/2M/S WPM B5 c SH MS 1/2MS WPM B5 a b SH MS 1/2MS WPM B5
25 số lượng chồi hình thành trên mẫu cấy tương ứng là 1,0 và 0,67 chồi/mẫu. Các chồi này có kích thước nhỏ, màu xanh đôi khi viền là màu tím, có thể hình thấy bằng mắt thường khi quan sát mà không cần đến kính lúp.
Bảng 2. Tác động của môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh chồi trên mẫu phôi sâm Lang Bian
Giai đoạn sinh trưởng Môi trường nuôi cấy Tỉ lệ mẫu tạo chồi Số chồi/mẫu Đặc điểm (%) SH 0,00f 0,00g Chưa hình thành chồi. MS 0,00f 0,00g Chưa hình thành chồi. 30 ngày 1/2 MS 26,67d 1,00ef
Chồi xanh, khỏe.
WPM 49,00c 0,67fg
Chồi xanh, khỏe.
B5 0,00f 0,00g
Chưa hình thành chồi.
SH 13,33e 0,67fg Xuất hiện chồi nhỏ.
MS 0,00f 0,00g Chưa hình thành chồi.
60 ngày 1/2 MS 94,33ab 2,17cd Chồi xanh, khỏe.
WPM 99,33a 3,00c Chồi xanh, khỏe.
B5 0,00f 0,00g
Chưa hình thành chồi.
SH 86,67b 2,67c Ít chồi, chồi có màu xanh,
lá có viền tím.
MS 100a 7,17b Chồi có màu xanh, khỏe.
90 ngày 1/2 MS 100a 18,83a Chồi lớn, có màu xanh, lá
có viền tím.
WPM 100a 7,33b Chồi lớn, khỏe, chồi có
màu xanh.
B5 86,67b 1,67de
Chồi khỏe, có màu xanh.
CV% 0,18 0,24
Ghi chú: Những chữ cái khác nhau (a, b…) được nêu trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với α = 0,05.
26 Số lượng chồi hình thành ở thời điểm 60 ngày nuôi cấy có sự thay đổi, môi trường SH đã bắt đầu có sự cảm ứng tạo chồi (bảng 2). Môi trường MS, B5 vẫn chưa thấy có sự phát sinh hình thái chồi trên mẫu cấy. Trên môi trường 1/2 MS tỉ lệ mẫu tạo chồi tăng từ 26,67% lên 94,33% và chiếm tỉ lệ cao nhất (99,33%) trên môi trường WPM. Số lượng chồi trên hai môi trường này cũng có sự tăng trưởng với số chồi lần lượt là 2,17 chồi/mẫu và 3,0 chồi/mẫu. Các chồi này thường có màu xanh đậm, đôi khi xuất hiện màu tím quanh cuống, lá của chồi. Số lượng chồi trên các môi trường còn lại không có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê.
Vào ngày thứ 90 sau nuôi cấy, mẫu phôi có sự gia tăng về tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi cũng như số lượng chồi mới tạo thành. Các chồi này có sự tăng trưởng về kích thước và thường có màu xanh đậm một số ít có màu tím, phát triển từ các dạng phôi được hình thành ở giai đoạn trước đó tạo nên chồi mới với số lượng chồi lớn (hình 3c). Vì vậy, tỉ lệ mẫu tạo chồi và số lượng chồi hình thành trên mỗi mẫu nuôi cấy đều cao từ 86,67% trở lên. Trong đó, môi trường 1/2 MS có số lượng chồi cao nhất là 18,83 chồi/mẫu (bảng 2). Số lượng chồi tạo thành giữa hai môi trường là MS và WPM lại không có sự khác biệt về mặt thống kê, với số chồi là 7,17 chồi/mẫu và 7,33 chồi/mẫu. Trên môi trường SH, B5 số lượng chồi được hình thành khi nuôi cấy mẫu đều thấp chỉ khoảng 2,67 và 1,67 chồi.
Như vậy, qua chỉ tiêu về tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi, số lượng và hình thái chồi hình thành sau 90 ngày nuôi cấy có nhận thấy, mẫu phôi được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS là thích hợp cho khả năng phát sinh chồi với số lượng chồi tạo thành là 18,83 chồi/mẫu. Sự khác biệt về dinh dưỡng khoáng trên mỗi môi trường nuôi cấy đã cho kết quả khác nhau về tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi và số lượng chồi phát sinh là khác nhau. Ở các thời điểm trước đó 30 ngày và 60 ngày, môi trường 1/2 MS cũng cho thấy khả năng cảm ứng chồi nhanh của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, môi trường WPM cũng cho tỉ lệ mẫu cảm ứng tạo chồi cao nhưng số lượng chồi hình thành chỉ khoảng 7,17 chồi/ mẫu, các môi trường còn lại SH, MS và B5 cũng có cảm ứng tạo chồi nhưng chậm, chồi nhỏ.
Trong nghiên cứu này, sự phát triển của chồi cũng quyết định đến sự gia tăng khối lượng tươi, khối lượng khô của sâm Lang Bian (Biểu đồ 3). Khối lượng tươi, khối lượng khô của mẫu phôi sâm Lang Bian gia tăng nhiều nhất (899,1 mg/mẫu và
27 68,23 mg/mẫu) khi được nuôi cấy trong môi trường 1/2 MS, ít nhất (275,3 mg/mẫu và 45,67 mg/mẫu) ở môi trường SH. Các môi trường còn lại cũng có sự gia tăng về khối lượng tăng dần từ môi trường B5, WPM đến MS với khối lượng tươi tăng dần là 417,90 mg/mẫu, 471,10 mg/mẫu và 578,3 mg/mẫu. Khối lượng khô của mẫu trên ba môi trường cũng có sự khác biệt, môi trường B5 và WPM có khối lượng khô là 54,53 mg/mẫu, môi trường MS có khối lượng khô cao nhất trong ba môi trường này là 67,70 mg/mẫu. Sự khác biệt về khối lượng trên ba môi trường này có thể lý giải là do mẫu thu ban đầu có khối lượng tươi cao là do sự tăng trưởng về số lượng chồi, phôi trên môi trường WPM nhưng trên môi trường B5 có thêm sự xuất hiện của các