Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tách, trong đĩ pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hố học với các nhĩm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ [117].
Khi chạy sắc ký, quá trình hấp phụ và giải hấp liên tục xảy ra, từ lúc nạp chất mẫu vào cho đến lúc các chất đi ra khỏi cột sắc ký, trong cột tách luơn luơn cĩ 3 tương tác:
- Tương tác pha tĩnh với chất phân tích, cĩ lực F1. - Tương tác pha động với chất phân tích, cĩ lực F2. - Tương tác pha động với pha tĩnh, cĩ lực F3.
Trong 3 tương tác này: F3 là khơng đổi (trong 1 hệ pha), F1 và F2 ngược chiều nhau, F1 giữ chất phân tích lại trên pha tĩnh, F2 kéo chất phân tích vào pha động.
Lực lưu giữ các chất trong quá trình sắc ký F = (F1 + F2 + F3)
Do đĩ trong một hỗn hợp mẫu, chất nào cĩ lực F nhỏ nhất sẽ ra khỏi cột tách trước tiên, chất nào cĩ lực F lớn nhất sẽ ra sau cùng.
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của hãng Agilent là hệ thiết bị phân tích để xác định cụ thể số lượng tạp chất và tính tốn dựa trên tỉ lệ phần trăm diện tích và dựa trên đường chuẩn.
Các mẫu sản phẩm được định lượng 4-AP bằng phương pháp HPLC với các thơng số kỹ thuật và điều kiện vận hành như sau:
- Dung mơi: + Dung dịch Na2HPO4 1,79 % (DD 1): Hồ tan 45 g
Na2HPO4.12H2O trong 1000 mL nước.
+ Dung dịch KH2PO4 0,88 % (DD 2): Hồ tan 8,8 g KH2PO4 trong 1000 mL nước.
+ Dung dịch Tetrabutylamonium bromid 49 %: Hồ tan 4,9 g Tetrabutylamonium bromid trong 10 mL nước.
+ Dung dịch 0,46 % Tetrabutylamonium bromid 49 % trong Methanol (DD 3): Pha lỗng 4,6 mL dung dịch Tetrabutylamonium bromid 49 % với methanol vừa đủ 1000 mL. - Điều kiện sắc ký: + Cột C8 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm). + Nhiệt độ cột: 35 oC. + Tốc độ dịng: 1,5 mL/phút. + Thể tích tiêm: 20 μL. + Bước sĩng phát hiện: 245 nm. + Pha động: DD 1 : DD 2 : DD 3 (375 : 375 : 250).
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn p-AP vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30 mL MeOH, siêu âm hồ tan hồn tồn, bổ sung vừa đủ thể tích bằng MeOH, lắc đều. Hút chính xác 1,0 mL dung dịch trên vào bình định mức 20 mL, bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch chuẩn đem tiêm.
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 25 mg chế phẩm vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30 mL MeOH, siêu âm hồ tan hồn tồn, bổ sung vừa đủ thể tích bằng MeOH, lắc đều. Hút chính xác 1,0 mL dung dịch trên vào bình định mức 20 mL, bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm được dung dịch thử đem tiêm.
- Kết quả: hàm lượng p-AP trong mẫu được tính theo cơng thức sau:
𝑋 (%) = 𝑆𝑡 . 𝑚𝑐 . 𝐻𝐿𝑐 . 𝐷𝑡
Trong đĩ:
+ St, Sc là diện tích của mẫu thử, mẫu chuẩn.
+ Dt , Dc là độ pha lường của mẫu thử, mẫu chuẩn (mL). + mt, mc là khối lượng của mẫu thử, mẫu chuẩn (mg). + HLc là hàm lượng mẫu chuẩn (%).
Mẫu nghiên cứu được đo tại Trung tâm Kiểm nghiệm, Viện Thực phẩm chức năng.