1. Dụng cụ
- Bếp điện, kẹp, lưới amiăng - Nồi cách thủy - Phễu lọc - Quang phổ kế - Bình định mức 1000ml - Becher 100ml - Burette 25ml - Pipette 5ml, 10ml, 50ml - Ống đong 10ml - Ống nghiệm 2. Hóa chất • Thuốc thử DNS: - Nước cất 1416ml - Acid –3,5-dinitrosalicylic (C7H4N2O7) 10.6g - NaOH 19.8g
- Sau khi hòa tan, cho thêm vào dung dịch:
- Muối Seignett (KNaC4H4O6.4H2O) 306g - Phenol (C6H5OH) nóng chảy ở 500C 7.6ml - Natri metabisunfit (Na2S2O5) 8.3g
Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HCl 9,1N với 5÷6ml phenolphtalein. Nếu cần thêm NaOH
III. TIẾN HÀNH:
1. Dựng đồ thị chuẩn:
Pha dãy glucose chuẩn từ 0,2÷0,5mg trong 1ml. Cho 2÷4ml dung dịch glucose chuẩn vào một ống nghiệm, thêm 1-2 ml thuốc thử DNS. Đun sôi đúng 5 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Pha loãng mẫu nếu cần sao cho mật độ quang nằm trong khoảng 0,2÷0,8. Đo mật độ quang ở bước sóng 540nm với đối chứng là nước. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose. Đường thẳng thu được có thể cắt trục hoành ở 0,04mg glucose do glucose bị oxy hóa.
Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm như bài 9, nhưng chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức 1000ml thay vì 100ml như bài 9
Hỗn hợp phản ứng giữa glucose với thuốc thử DNS được tiến hành như phần xây dựng đồ thị chuẩn.
Đối với những mẩu có lượng đường khử thấp, thêm 0,1mg glucose vào mỗi mẫu. Cứ 3ml thuốc thử DNS này sẽ phẩn ứng hết với khoảng 10mg glucose. Những dung dịch đậm đặc phải được pha loãng sao cho mẫu đem phân tích chỉ chứa 4mg đường khử hoặc ít hơn.
* Chú ý:
- Màu của hỗn hợp chỉ được tạo thành trong môi trường kiềm. Vì vậy những mẫu acid phải được trung hòa trước khi đem phân tích.
- Phương pháp này không đặc hiệu cho tất cả các đường khử. Nếu glucose được dùng làm đường chuẩn thì xelobilose cho giá trị thấp hơn 15% còn cyclose lại cho giá trị cao hơn 15%
- Các mẫu đã đun có thể để một thời gian (20 phút) trước khi đo. Các mẫu không đun sẽ bị phân hủy dần
Phụ lục
PHƯƠNG PHÁP ĐINH LƯỢNG BẰNG 3.5-DINITROSALYCYLIC ACID1.1 Nguyên tắc 1.1 Nguyên tắc
Có một vài tác nhân được sử dụng để định lượng đường nhờ các đặc tính khử của đường. 3.5 – dinitrosalic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3-amino-5nitrosalicylic có màu đỏ cam.
NH2
Hóa học của phản ứng rất phức tạp bởi vì đường chuẩn không luôn luôn đi qua gốc tọa độ và mỗi một loại đường khử khác nhau sẽ thu được các màu sắc khác nhau. Vì thế, phương pháp này không thích hợp để xác định một hỗn hợp nhiều đường khử.
1.2 Hóa chất
1- Sodium potassium tartrate (hòa tan 300g muối này vào 500 ml nước).
2- 3.5- dinitrosalicylic acid: hòa tan 10g DNS vào 200 ml dung dịch NaOH 2M
3- Dinitrosalicylic dung cho phản ứng: trộn (1) vào (2), thêm nước cất cho đủ 1 lít. 4- NaOH 2M O2N Màu vàng COOH COOH OH NO2 OH khử hóa Màu đỏ cam O2N - -
5- Dung dịch đường chuẩn dự trữ (các dung dịch glucose, fructose và maltose 1g/l trong acid benzoic bão hòa).
6- Các dung dịch đường chuẩn thí nghiệm: pha loãng 1 thể tích các dung dịch glucose, fructose và maltose dự trữ thành 4 lần trước khi sử dụng. Dung dịch đường cuối cùng có nồng độ 250 μg/ml.
7- Một vài dung dịch đường cần xác định nồng độ. 8- Bể ổn nhiệt.
1.3 Phương pháp
Chỉ pha chế dung dịch thuốc thử DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, dung dịch này cần phải được giữ trong chai nâu và tránh CO2.
- Hút 3 ml dung dịch mẫu có chứa đường vào một ống nghiệm. - Thêm vào 1 ml thuốc thử DNS.
- Chuẩn bị ống thử không bằng cách thêm 1 ml thuốc DNS vào 3 ml nước cất. - Dùng một miếng nilon sạch bịt kín ống nghiệm, đặt vào nồi nước đang sôi trong 5 phút.
- Làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thu OD ở bước song 540 nm. Dùng ống thử không đễ chuẩn độ truyền suốt về 100%. Chú ý là tất cả các ống nghiệm cần phải được làm lạnh về nhiệt độ phòng trước khi đo bởi vì độ hấp thu rất nhạy với nhiệt độ.
- Dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ đường có trong dung dịch.
v Dựng đồ thị chuẩn
- Cân chính xác 1g glucose (dạng khô không ngậm nước) hòa tan thành 200 ml với nước cất. Sử dụng bình định mức.
- Hút lần lượt 1, 2, 3, 4 và 5 ml dung dịch đường này vào 5 bình định mức 50 ml. Thêm nước cho đến vạch định mức.
- Các dung dịch đường mới pha này có nồng độ glucose lần lượt là 0.10, 0.20, 0.30, 0.40 và 0.50 mg/ml.
- Thực hiện phản ứng như trên.
- Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên giữa nồng độ đường và độ hấp thu OD 540 nm.