Vật liệu nano đã được chứng minh là có tiềm năng vượt trội trong nhiều lĩnh vực. Số lượng các sản phẩm nano kim loại đã tăng đáng kể trong suốt thập kỷ qua. Một phần nhỏ của những sản phẩm này được phát triển phục vụ mục đích sức khỏe con người. Các sản phẩm còn lại thuộc các lĩnh vực điện tử, máy tính, ô tô, thiết bị gia dụng, thực phẩm, môi trường, vật liệu xây dựng, nông nghiệp,… Vì vậy mà mối lo ngại về hoạt động, ảnh hưởng của hàm lượng tồn dư nano trong môi trường ngày một gia tăng. Cho đến nay, con người ít biết rõ về sự an toàn của việc sử dụng các hạt nano trong môi trường. Các nhà nghiên cứu đã giải quyết vấn đề này bằng cách tập trung vào tương tác của nano với thực vật, động vật và con người thông qua nghiên cứu ảnh hưởng của chúng trong các hệ thống đất, nước, không khí. So với các
độc đối với con người dẫn đến sự phát triển hàng loạt các sản phẩm AgNPs có ứng dụng diệt khuẩn trong y học và đời sống [41]. Bên cạnh AgNPs, FeNPs cũng là loại hạt nano có tiềm năng ứng dụng cao. Đây là nano có khả năng khử nitrat, các hợp chất chlor hữu cơ vòng thơm và các kim loại nặng gây ô nhiễm môi trường mạnh nhất so với các nano kim loại khác, do đó nó được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực làm sạch môi trường đất, nước, không khí. Hơn nữa, nó là một kim loại rất thân thiện với môi trường, sản phẩm khử của nó là Fe2+ và Fe3+ tương đối ít nên cũng không gây độc với môi trường và sinh vật [49], [173], [175]. Vì vậy, trong nông nghiệp, AgNPs và FeNPs ngày càng được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong công nghệ trước và sau thu hoạch nông sản để hạn chế dịch bệnh phát triển, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, nâng cao chất lượng và kéo dài thời gian bảo quản của nông sản.
SƠ LƯỢC VỀ CÁC ĐỐI TƯỢNG CÂY TRỒNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 1.3.1.Cây salem Giới : Plantae Ngành : Spermatophytina Lớp : Magnoliopsida Bộ : Caryophyllanae Họ : Plumbaginaceae Chi : Limonium
Loài : Limonium sinuatum
Hình 1.4. Cây salem
(https://hoadepdalat.com/san-pham/tt01- salem-trang/)
Cây salem (Limonium sinuatum) thuộc họ Plumbaginaceae, phân bố rộng khắp châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Úc và Bắc Mỹ. Bao gồm hơn 150 loài, hoa salem chủ yếu có màu trắng, ngoài ra còn có màu tím, vàng, hồng, đỏ. Cây có lông, cao 60 – 100 cm, lá xẻ, dài 20 – 25 cm, gốc hoa phân nhánh, dạng tán, thưa, cành hoa dài [29]. Loài hoa này nổi tiếng với sức sống mãnh liệt, khả năng chống bệnh, chịu hạn rất tốt. Điều đặc biệt ở hoa salem là cho đến khi tàn, cánh hoa không rụng mà vẫn
còn nguyên, cánh hoa tựa như một tờ giấy; tuy đã khô héo nhưng gần như vẫn giữ được một vẻ đẹp rất riêng, không bị mất màu [95]. Cây ưa khí hậu khô mát, ưa sáng, sống ở vùng có ít đá vôi, kị nóng và ẩm ướt, là loại cây xuất hiện ở nước ta đầu tiên tại Đà Lạt năm 1975 và từ đó được trồng quanh năm và trở nên rất phổ biến do khí hậu ôn hòa ở Đà Lạt rất thích hợp cho cây phát triển, được dùng làm hoa cắt cành và hoa khô, chủ yếu được tiêu thụ trong nước và xuất khẩu [139]. Cây hoa salem là một trong 20 loại hoa được thương mại hóa nhiều nhất trên thế giới. Sản lượng hoa cắt cành của Hà Lan tăng từ 50 triệu cành (2010) lên 72 triệu cành (2014), tương ứng với giá trị là 10,8 và 15 triệu euro [109]. Sản lượng cành hoa salem của Nhật Bản dao động từ 118 - 127 triệu cành từ năm 2006 – 2008 [72]. Đà Lạt là nơi có diện tích trồng hoa salem lớn nhất Việt Nam. Hiện nay, sản lượng hoa salem của Đà Lạt chỉ đáp ứng được nhu cầu trong nước. Hiện nay, thị trường lớn và tiềm năng của hoa salem tại khu vực miền Bắc (chủ yếu là Hà Nội), miền Trung (Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, Bình Định, Khánh Hòa,...), Tây Nguyên (Gia Lai, Đắk Lắk,…) và miền Nam (chủ yếu là Thành phố Hồ Chí Minh). Cây salem có thể nhân giống bằng gieo hạt nhưng không phổ biến do số lượng hạt rất ít, cây con yếu, sức sống kém, chất lượng hoa không đẹp như cây mẹ, thời gian sinh trưởng và phát triển chậm. Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô phổ biến hơn do tạo được nguồn cây giống sạch bệnh, ổn định, độ đồng nhất cao [17]. 1.3.2.Dâu tây Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Rosales Họ : Rosaceae Chi : Fragaria
Loài : Fragaria x ananassa
Hình 1.5. Cây dâu tây
Cây dâu tây (Fragaria × ananassa) thuộc họ Rosaceae là cây thân thảo thấp, lâu năm. Trái dâu tây đỏ, mọng, có nhiều nước ở dạng hình nón. Cây dâu tây là một trong những cây ăn trái quan trọng của thế giới, chứa nhiều khoáng chất cần thiết cho nhu cầu dinh dưỡng của con người [162]. Theo tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc, hơn 80 quốc gia trên thế giới canh tác cây Dâu tây, với tổng diện tích là 372.361 ha và đạt tổng sản lượng là 8.337.099 tấn vào năm 2018 (Internet 1). Các nước Mỹ, Mexico, Thổ Nhĩ Kỳ, Tây Ban Nha, Ai Cập và Trung Quốc là những nước có sản lượng Dâu tây hàng đầu thế giới, trong đó Trung Quốc là nước sản xuất lớn nhất. Sản lượng Dâu tây tiếp tục tăng trong những năm gần đây, đặc biệt là ở châu Á, Bắc Mỹ, Trung Mỹ và Bắc Phi cùng với sự gia tăng nhu cầu ở nhiều nơi trên thế giới [145]. Tại Việt Nam, cây dâu tây được trồng chủ yếu ở Đà Lạt và một số vụ tại đồng bằng sông Hồng. Thống kê trong năm 2015, diện tích trồng cây Dâu tây ở Lâm Đồng đạt khoảng 115 ha (diện tích trồng trong nhà kính khoảng 13 ha), gồm 80 ha ở các phường 4, 6, 7, 8, 9, 11 và xã Xuân Thọ thuộc thành phố Đà Lạt và 35 ha ở các xã Lát, Đạ Sar, Đạ Nhim thuộc huyện Lạc Dương (Internet 2). Đến năm 2018, tổng diện tích cây Dâu tây trên địa bàn tỉnh Lâm Đồng là gần 190 ha (diện tích trồng trong nhà kính gần 50 ha) với sản lượng trên 2.200 tấn. Thành phố Đà Lạt vẫn là địa phương trồng cây Dâu tây chủ lực của tỉnh Lâm Đồng, với khoảng 120 ha (Internet 3). Cây dâu tây được nhân giống bằng cách tách cây con (runner) vào những năm đầu thế kỷ XIX. Cây dâu tây được rất nhiều người ưa chuộng và được tiêu thụ với số lượng lớn dưới nhiều dạng sản phẩm như quả tươi, đông lạnh, mức, nước giải khát… Chính vì vậy, đây là loại quả mang lại giá trị kinh tế lớn. Ngoài ra, trái dâu tây có tầm quan trọng về khả năng cung cấp các sinh tố có lợi cho sức khỏe con người [62]. Các chất sinh tố này thuộc 4 nhóm chính là các vitamin, các chất khoáng, các amino acid, và chất béo. Các vitamin bao gồm các vitamin A, B1, B2, đặc biệt là hàm lượng vitamin C rất cao, nhiều hơn cả cam và dưa hấu. Thành phần khoáng kể đến chủ yếu là Ca, P, Fe, trong đó hàm lượng Fe có trong quả dâu tây thậm chí còn lớn hơn các loại trái cây khác như cây cam, quýt, xoài; ít hơn là các thành phần như Mg, K, Na, Zn, Cu, Se. Trong thành phần các amino acid, phổ biến là tryptophan, threonine, isoleucine,
các sản phẩm từ quả dâu tây làm tăng hàm lượng sinh tố trong cơ thể giúp chống lại mệt mỏi, giảm stress, chữa các bệnh về lợi, tăng sức đề kháng, chống nhiễm trùng, chữa bệnh về tim mạch và giảm thiểu sự lão hóa cơ thể. Cây dâu tây có thể nhân giống truyền thống bằng cách gieo hạt nhưng sản lượng kém, chất lượng quả không cao như cây mẹ [154]. Khi diện tích sản xuất được mở rộng, nhu cầu về cây giống có chất lượng cũng không ngừng tăng theo. Phương pháp vi nhân giống có thể tạo ra số lượng cây giống sạch bệnh, chất lượng đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền trong thời gian ngắn; đặc biệt phương pháp này có hiệu quả khi kết hợp với phương pháp tách cây ngó từ cây mẹ [34]. 1.3.3.Sâm Ngọc Linh Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Magnoliopsida Bộ : Apiales Họ : Araliaceae Chi : Panax
Loài : Panax vietnamensis Ha et Grushv
Hình 1.6. Cây sâm Ngọc Linh (https://samnuingoclinh.net/hinh- anh-cay-sam-ngoc-linh)
Cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) thuộc họ Araliaceae. Sâm Ngọc Linh là một trong những loài cây có hàm lượng saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12-15%) và hàm lượng saponin nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới [1]. Với những đặc điểm đó, sâm Ngọc Linh không chỉ là loài cây quý của Việt Nam mà còn của cả thế giới. Hiện nay sâm Ngọc Linh đang nằm trong 250 loài cây quý hiếm, đang có nguy cơ tuyệt chủng trong Sách đỏ Việt Nam. Giá sâm Ngọc Linh tăng lên rất cao, đạt 20 – 30 triệu đồng/kg sâm tươi và 60 – 80 triệu đồng/kg sâm khô. Các công trình nghiên cứu dược lý và lâm sàng cho thấy cây sâm Ngọc Linh có những tác dụng rất giống sâm Triều Tiên. Gần đây các thử nghiệm
dụng chống stress và là một chất xúc tiến chống ung thư quan trọng. Ngoài ra, chúng còn nhiều tác dụng khác như kích thích hoạt động thần kinh và trí nhớ ở liều thấp, chống trầm cảm, tăng sinh lực, chống oxy hóa, tăng cường sức đề kháng, tác dụng phục hồi máu, tăng cường nội tiết tố sinh dục, điều hòa hoạt động của tim, tác dụng chống tăng cholesterol máu, tác dụng bảo vệ gan khỏi các yếu tố gây độc đối với gan [4]. Vì vậy, Tháng 9/2015, chính phủ đã phê duyệt đề án quốc gia về phát triển sâm Ngọc Linh đến năm 2030 với mục tiêu mở rộng vùng trồng sâm ra 7 xã của huyện Nam Trà My (Quảng Nam) với tổng diện tích trên 30,000 hecta, mức đầu tư trên 9,000 tỷ đồng. Ngày 18/6/2016 Sâm củ Ngọc Linh được Cục Sở hữu trí tuệ cấp giấy chứng nhận đăng ký chỉ dẫn địa lý số 00049 theo quyết định số 3235/QĐ-SHTT. Theo quyết định này, sản phẩm củ sâm mang chỉ dẫn địa lý nằm trên núi Ngọc Linh trong khu vực địa lý thuộc tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Ngày 1 – 3/10/2017 phiên chợ sâm Ngọc Linh được tổ chức lần thứ nhất tại huyện Nam Trà My và sau đó được tổ chức hàng tháng nhằm mục đích cung cấp sâm Ngọc Linh có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng đến người tiêu dùng. Tuy nhiên, nhân giống cây sâm Ngọc Linh gặp nhiều khó khăn do địa bàn phân bố hẹp, thời gian nuôi trồng kéo dài, nhân giống hữu tính (gieo hạt) không cho kết quả cao. Vì vậy, cần thiết ứng dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại. Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến có thể áp dụng tốt cho sản xuất sản phẩm sâm Ngọc Linh. Bằng phương pháp nuôi cấy mô có thể tạo ra được nguồn giống với số lượng lớn cung cấp cho người dân, từ đó có thể xã hội hóa việc trồng cây sâm Ngọc Linh, mang lại lợi ích kinh tế cho các đồng bào dân tộc và phát triển thương hiệu sâm Việt Nam trên thế giới [2].
Tóm lại, vi nhân giống là phương pháp sản xuất cây giống hoàn toàn sạch bệnh với số lượng lớn trong nông nghiệp và lâm nghiệp. Hiệu quả nhân giống trên quy mô thương mại phụ thuộc vào mức độ phát triển nhanh của cây in vitro trong giai đoạn nhân giống, tỷ lệ sống cao trong giai đoạn thuần hoá và sản phẩm đạt chất lượng cao trong sản xuất [17]. Sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong vi nhân giống chịu nhiều ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy - cây sinh trưởng trong bình nuôi cấy
ẩm cao, mức độ carbohydrate và hormone cao, ánh sáng có cường độ thấp, áp lực nước và áp suất thẩm thấu thấp, sự trao đổi khí O2 và CO2 thấp, tích luỹ khí ethylene trong bình nuôi cấy. Những yếu tố này trong vi nhân giống giúp cây tăng sinh nhanh, nhưng thường phát sinh những trạng thái sinh lý, cấu trúc và hình thái không bình thường dẫn đến hiệu quả của quá trình nhân giống in vitro không cao, tỷ lệ sống sót trong giai đoạn thuần hoá thấp, tạo ra các sản phẩm không đạt chất lượng, giá thành sản xuất tăng [20]. Trong một vài hệ thống vi nhân giống cây hoa, cây ăn quả và cây dược liệu trên quy mô công nghiệp đang gặp phải những vấn đề khó khăn như hiệu quả của quá trình khử trùng bề mặt không cao, hiện tượng tái nhiễm trong quá trình nhân giống, hiệu quả của quá trình nhân giống thấp, lượng cây con bị chết khi chuyển ra ngoài điều kiện vườn ươm khoảng 10 – 40% hoặc cao hơn nữa [10]. Vì vậy, việc tạo được cây in vitro có chất lượng cao trong vi nhân giống sẽ quyết định được hiệu quả kinh tế trong quá trình sản xuất. Cho đến nay, các thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, hệ thống nuôi cấy, quang chu kỳ,... đã được nghiên cứu và sử dụng phổ biến trong vi nhân giống thực vật; nhưng trong một vài quy trình nhân giống vẫn chưa mang lại hiệu quả cao như mong đợi [20]. Do đó rất cần thiết phải tìm ra một nhân tố mới trong vi nhân giống thực vật sẽ mang lại những lợi ích đáng kể trong việc nâng cao chất lượng cây giống. Trong đó, vật liệu nano đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong nước và trên thế giới. Đặc biệt, AgNPs và FeNPs được thu hút nhiều hơn so với các nano kim loại khác; do chúng có nhiều tính chất, đặc trưng được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực vi nhân giống thực vật [85]. Với những ưu điểm mà vật liệu nano mang lại thì AgNPs có thể thay thế các chất khử trùng thông dụng [Ca(ClO)2, HgCl2] trong khử trùng bề mặt mẫu cấy cũng như một chất điều hoà sinh trưởng điều tiết các quá trình phát sinh hình thái, sinh trưởng và phát triển thực vật; FeNPs có thể như một nguồn vật liệu mới thay thế Fe- EDTA trong môi trường vi lượng.
CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU
2.1.1.Vật liệu thực vật
Lá non của cây salem (Limonium sinuatum) và dâu tây (Fragaria × ananassa) 3 tháng tuổi, sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) 3 năm tuổi sinh
trưởng và phát triển tốt, không bị sâu bệnh thu nhận tại vườn ươm của Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) được sử dụng làm vật liệu cho nghiên cứu.
2.1.2.Dung dịch nano
Dung dịch AgNPs và FeNPs hóa trị 0 nồng độ 1000 ppm do Viện Công nghệ Môi trường (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) chế tạo và cung cấp [46].
AgNPs có kích thước 20 – 25 nm được chế tạo bằng phương pháp khử dung dịch nước sử dụng tiền chất là AgNO3, tác nhân khử là sodium borohydride (NaBH4) và chất ổn định được sử dụng là chitosan. AgNPs được sử dụng trong khử trùng bề mặt và bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro.
FeNPs có kích thước 20 – 60 nm được chế tạo bằng phương pháp khử dung dịch nước sử dụng tiền chất là FeSO4.7H2O. NaBH4 được sử dụng làm chất khử và carboxymethyl cellulose (CMC) làm chất ổn định. FeNPs được sử dụng thay thế Fe- EDTA trong môi trường nuôi cấy in vitro.
2.1.3.Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
Thiết bị và dụng cụ: Cân điện tử, máy cất nước, máy đo pH, nồi hấp vô trùng,
tủ cấy vô trùng, máy đo hàm lượng chlorophyll SPAD-502 (Minolta Co., Ltd., Osaka, Nhật Bản), tủ sấy Sanyo MOV-112, tủ sấy Memmert, cân kỹ thuật Prescisa (Nhật Bản), đèn UV hai bước sóng 254 nm và 365 nm, ẩm kế (JR-900A, Trung Quốc), máy lắc Hermle (Ðức), kính hiển vi soi nổi C-BD230 và CH30RF200, kính hiển vi điện tử huỳnh quang, kính hiển vi điện tử quét FE SEM S4800, máy quang phổ hấp phụ AAS-6650, máy sắc ký khí GC-CP 3380, đèn cồn, dao cấy, đĩa cấy, panh cấy, kéo,
Hoá chất: Agar, gelrite (Việt Xô, Cty Phan Trần, Hồ Chí Minh); sucrose (Biên
Hoà, Đồng Nai); các hoá chất được sử dụng trong môi trường MS (Murashige và Skoog) hoặc SH (Schenk và Hildebrandt), chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Merck, Sigma, Duchefa).
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU