ARN tổng số được tách chiết từ dịch tế bào Marc 145 chứa virus bằng phương pháp Trizol. Nồng độ ARN được xác định bằng máy NanoDrop. ARN được chuyển sang cADN bằng enzyme phiên mã ngược Super ScriptTMII Reverse
transcriptase (Fermentas) ở nhiệt độ 50oC trong 30 phút và tiền biến tính ở nhiệt độ 94oC trong 2 phút. Tổng hợp ADN sợi kép bằng enzyme Platinum Taq DNA polymerase dựa trên sợi khuôn là cADN. Phản ứng PCR được tiến hành để khuếch đại các phân đoạn khác nhau của hệ gen virus PRRS với mỗi cặp mồi tương ứng và chu kỳ nhiệt thích hợp là 94oC/3 phút (94oC /15 giây, 50oC /50 giây, 72oC /1 phút 30 giây), lặp lại 30 chu kỳ như trên, 72oC /8 phút, 4 oC -.
2.2.15. Phương pháp tách dòng và giải trình tự gen
Sản phẩm PCR được tạo dòng bằng cách gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR 2.1 với việc sử dụng bộ TA cloning Kit của hãng Invitrogen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bào E. coli chủngTop 10F‘ bằng phương pháp sốc nhiệt. Plasmid chứa các phân đoạn gen được tách chiết từ các khuẩn lạc trắng và kiểm tra các đoạn gen chèn bằng cắt với enzyme hạn chế
EcoRI. Tinh sạch plasmid tái tổ hợp để phục vụ cho việc giải trình tự gen được thực
hiện bằng bộ KIT S.N.A.P Miniprep Kit của hãng Fermentase. Phản ứng xác định trình tự được thực hiện nhờ bộ kit BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems, sử dụng hai mồi xuôi và ngược M13F và M13R. Xác định trình tự tự động trên hệ thống ABI 3100, phân tích trình tự bằng phần mềm BioEdit và DNA Star.
TT Tên mồi Trình tự (5’-3’) Độ dài
(Nucleotide) Tm ước tính o ( C) Sản phẩm PCR (bp) PRRSM12 AAGAATATGATGATATCAACAATGG 25 13 PRRSP13 TTACAAAATTGGCCAACTTTTTGTGG 26 56 955 PRRSM13 CCGTGTAGCTGAAGGACAAGAACG 24 14 PRRSP14 GGGTTTATGATACCGCCTGG 20 50 1.267 PRRSM14 CCAGAAGAAAGTTGGTATATCTGG 24 15 PRRSP15 CATTTACAGTTGATTTATAACTTAACG 27 48 1.472 PRRSM15 GGTCGCCCTAATTGAATAGG 20
2.2.16. Phương pháp so sánh trình tự gen và tạo cây phả hệ
Trình tự nucleotide và protein vùng ORF5 mã hóa kháng nguyên GP5 của virus PRRS 02HY cường độc và Hanvet1.vn nhược độc, các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh thành trong nước và khu vực được thu nhận từ Ngân Hàng gen NCBI (được thống kê trong bảng phần Phụ lục). Trình tự nucleotide và protein được so sánh bằng chương trình phần mềm BioEdit sau đó xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA6 sử dụng thuật toán Neighbor-Joining.
2.2.17. Phương pháp điện di
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm được sử dụng là TAE và agarose để tạo bản gel.
Chuẩn bị bản gel bằng dung dịch đệm TAE 1X hòa tan với 1,5 gam agarose đặt trong lò vi sóng ở 100oC trong 5 phút, đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel có các giếng tra mẫu. Khi bản gel đã đông đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TAE ngập bản gel khoảng 3-5mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2l loading dye vào 8l sản phẩm RT-PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản gel. Điện di đồng thời cả thang chuẩn ADN (marker), thường sử dụng 4-6l ADN marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide trong khoảng 5 đến 7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn ADN được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
2.2.18. Phương pháp IPMA xác định hiệu giá kháng thể
Chuẩn bị:
- Môi trường phát triển tế bào MEM với 5%FCS
- Dung dịch A: Dung dịch cố định tế bào, gồm PBS có 10% Formalin và 1% NP40.
- Dung dịch B: Dung dịch nước rửa, gồm PBS với 1% Tween 80.
- Dung dịch C: Dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS với 1% Tween 80 và 5% sữa gầy.
- Dung dịch E: Dung dịch AEC, gồm 1ml dung dịch AEC nguyên chất và 14ml dung dịch đệm axetat 0,1M (pH 5,2) sau đó thêm 15µl H2O2 30%.
- Tế bào Marc 145 một lớp.
- Giống virus chuẩn PRRS VN07196.
Các bước tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị tế bào Marc 145 một lớp trên đĩa 96 giếng với nồng độ 5x104 tế bào/ml.
Bước 2: Nhiễm virus PRRS chuẩn với liều 500TCID50/ml, 100µl/ giếng. Ủ đĩa từ 1-2 ngày trong tủ ấm 37 oC, 5% CO2.
Bước 3: Cố định tế bào đã nhiễm virus + Bỏ môi trường duy trì tế bào trong đĩa + Cho 100µl dung dịch A vào mỗi giếng + Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
+ Đổ bỏ dung dịch A, rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch B Bước 4: Gắn mẫu cần kiểm tra
+ Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, huyết thanh đối chứng dương.
+ Chuyển 50µl huyết thanh đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau vào các giếng. + Ủ đĩa ở 37oC trong 30 phút.
+ Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch B. Bước 5: Gắn kháng kháng thể PRRS có gắn enzyme (conjugate + peroxidase) (kháng thể này được chế trên thỏ)
+ Pha loãng conjugate trong dung dịch B theo tỷ lệ 1/600. + Nhỏ 50µl conjugate đã pha loãng vào các giếng.
+ Ủ đĩa 37 oC trong 30 phút
+ Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch B. Bước 6: Cho cơ chất
+ Ủ đĩa ở nhiệt độ 25oC trong 30 phút.
- Bước 7: Đọc kết quả dưới kính hiển vi soi ngược
+ Nếu quan sát thấy thảm tế bào trong giếng có những đám tế bào bắt màu đỏ đậm thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó dương tính với kháng thể PRRS.
+ Nếu quan sát thấy toàn bộ thảm tế bào trong giếng có màu hồng nhạt là màu của môi trường MEM thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó âm tính với kháng thể PRRS (TCVN 8400-21:2014).
2.2.19. Phương pháp đếm tế bào Marc 145
Sử dụng buồng đếm Newbauer cải tiến, chuẩn bị buồng đếm tế bào. Hút 100µl huyễn dịch tế bào trộn đều với 100µl thuốc nhuộm tế bào Trepan blue nhỏ vào buồng đếm. Đếm tổng số tế bào ở 4 góc và tính số lượng tế bào trong 1ml huyễn dịch. Công thức: [Tổng số tế bào đếm được ở 4 góc/4]*2*104
(Alan D et al,. 1999).
2.2.20. Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết và an toàn của virus giống gốc
+ Kiểm tra vô trùng (TCVN 8684-2011) Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn
Tiến hành cấy mẫu giống gốc Hanvet1.vn trên 2 ống môi trường kiểm tra sau đây: Môi trường Thioglycollat, môi trường Trypticaza đậu tương, 2 đĩa môi trường Thạch máu, lượng mẫu cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra.
Ủ môi trường đã cấy trong tủ 37oC, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày.
Mẫu giống gốc đạt tiêu chuẩn khi không có vi sinh vật mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc
Mẫu giống gốc Hanvet1.vn được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20oC đến 25oC). Mẫu đạt tiêu chuẩn khi không có nấm mốc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.
+ Kiểm tra tính thuần khiết
Sử dụng kỹ thuật PCR/RT PCR phát hiện các loại virus Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), Transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Classical swine fever virus (CSFV), Porcine circovirus type 2 (PCV2), Porcine parvovirus (PPV),
sau đó điện di sản phẩm để kiểm tra so sánh với đối chứng dương chuẩn, đối chứng âm và marker DNA/cDNA để xác định kết quả.
+ Kiểm tra chỉ tiêu an toàn
Tiêm bắp sau vành tai cho 04 lợn 5 tuần tuổi với liều 106TCID50 giống gốc Hanvet1.vn nhược độc, sau 7 ngày lấy máu 04 lợn, mỗi con 1ml tiêm truyền tiếp sang 04 lợn khác. Quá trình tiếp truyền được tiến hành lặp lại liên tục 5 đời lợn (đời 01 đến đời 05). Theo dõi lợn trong suốt quá trình thí nghiệm, nếu tất cả lợn sống khỏe mạnh, không có bất cứ phản ứng cục bộ hay toàn thân nào (lợn có thể có phản ứng sốt nhẹ, tăng 0,5oC) thì giống gốc vaccine đạt chỉ tiêu an toàn.
2.2.21. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch trên lợn với vaccine Hanvet1.vn
Lợn con 4 tuần tuổi, đồng đều về giống, tình trạng sức khoẻ, điều kiện chăn nuôi và vệ sinh thú y. Phân chia ngẫu nhiên số lợn trên vào các nhóm, sử dụng vaccine Hanvet1.vn được chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn nhược độc cho các nhóm với liều tiêm bắp như nhau. Theo dõi và xác định hiệu giá kháng thể sau khi tiêm vaccine. Đánh giá sự hình thành đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch sau khi tiêm vaccine bằng lấy máu lợn tại các thời điểm sau tiêm vaccine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 tuần để xác định hiệu giá kháng thể bằng IPMA và lấy máu lợn tại các thời điểm sau tiêm vaccine 2, 3, 4, 5, 6 tháng để xác định hiệu giá kháng thể trung hòa. Để đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine với chủng virus cường độc, tiêm vaccine cho 12 lợn 4 tuần tuổi có huyết thanh âm tính với kháng thể PRRS. Sau tiêm 28 ngày, lấy máu 12 lợn được miễn dịch (lô thí nghiệm) và 4 lợn không tiêm vaccine (lô đối chứng) để kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng IPMA và phản ứng trung hòa trên tế bào. Sau đó lợn thí nghiệm và đối chứng được thử thách với chủng virus PRRS cường độc VN07196 Việt Nam với liều 106TCID50. Sau khi công cường độc, theo dõi các biểu hiện lâm sàng, thân nhiệt, khả năng tăng trọng, đồng thời lấy máu lợn ở các thời điểm 3, 5, 7, 10, 14, 21 ngày sau khi công cường độc để phân lập, xác định virus huyết và mổ khám xác định bệnh tích (Yu et al,. 2015).
2.3.22. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Xác định sự tương đồng về nucleotide của phân đoạn gen thu được trong nghiên cứu bằng phần mềm Bioedit version 7.2.5. Xác định nguồn gốc phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gen của chủng virus thu nhận được bằng phần mềm MEGA version 6.0. Các số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2010, sử dụng phương pháp thống kê sinh học, Minitab 16.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Nghiên cứu đánh giá độc lực và đặc tính sinh học 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB
Thực nghiệm gây nhiễm 02 chủng virus PRRS 02HY và 05TB trên lợn để kiểm tra độc lực và các đặc tính sinh học của 2 chủng PRRS thông qua đánh giá khả năng gây bệnh tích điển hình, đặc trưng, các biểu hiện triệu chứng lâm sàng, chỉ số virus huyết, khả năng kích thích sinh kháng thể miễn dịch của lợn, khả năng gây bệnh tích tế bào, khả năng nhân lên, thích ứng của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145 là các tiêu chí cơ bản để chọn chủng virus cường độc phục vụ mục đích tạo giống gốc cho chế tạo vaccine PRRS nhược độc.
3.1.1. Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY và 05TB
Gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY và 05TB qua đường tiêm bắp sau tai trên tổng số 12 lợn, 6 lợn/1 lô, lô đối chứng 03 lợn, toàn bộ lợn thí nghiệm ở lứa tuổi từ 5 tuần tuổi với liều 1ml x 104TCID50/1lợn, theo dõi trong 14 ngày. Kết quả theo dõi biểu hiện lâm sàng của lợn thí nghiệm được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả biểu hiện lâm sàng của lợn gây nhiễm virus PRRS chủng 02HY và 05TB Số Lô Số lợn/1lô Chủng virus Liều gây nhiễm Số lợn
ốm Triệu chứng biểu hiện
1 6 02HY 1ml
4
10 TCID50
6
Ốm, sốt, bỏ ăn hoặc ăn ít, phát ban, sưng mí mắt, tai xanh, khó thở, ho, táo bón, vận động lờ đờ. Có 2 lợn sốt cao
o
42 C, co giật, ăn ít trở lại và hồi phục dần sau 13-14 ngày sau gây nhiễm
2 6 05TB 1ml
4
10 TCID50
6
Ốm, sốt, bỏ ăn hoặc ăn ít, phát ban, sưng mí mắt, tai tím, khó thở, ho, táo bón, rối loạn vận động, ăn ít trở lại và hồi phục dần sau 9-10 ngày sau gây nhiễm
3 3 Đối
chứng 0
Lợn khỏe, phát triển bình thường, không có biểu hiện lâm sàng của lợn mắc PRRS
+ Lô thí nghiệm số 1:
Triệu chứng lâm sàng chủ yếu xuất hiện trên lợn thí nghiệm:
Ngày thứ 3-4 sau gây nhiễm lợn ốm, ủ rũ, mệt mỏi và kéo dài 4-5 ngày; sưng mí mắt, mắt có nhử kéo dài đến ngày thứ 14.
Tai xanh nhạt xuất hiện vào ngày thứ 4 sau gây nhiễm ở 3/6 lợn (chiếm 50%) số lợn sau đó hồi phục, hiện tượng tai xanh mất dần.
Hắt hơi và ho vào ngày thứ 5 sau gây nhiễm, tăng dần ở ngày thứ 9-10 sau đó thuyên giảm.
Lợn kém ăn bắt đầu vào ngày thứ 3-4 sau gây nhiễm, bỏ ăn 1-3 ngày, ăn ít trở lại sau 10-11 ngày từ sau khi gây nhiễm virus PRRS, sau 13-14 ngày lợn hồi phục dần, không có lợn chết.
Thân nhiệt tăng đến 41-42oC vào ngày ngày thứ 4, sốt cao kéo dài 3-5 ngày, 02 lợn có hiện tượng co giật, kèm theo sốt là ban đỏ, thở khó, thở nhanh, táo bón xuất hiện ngày thứ 6 và kéo dài 4-6 ngày sau đó.
+ Lô thí nghiệm 2:
Theo dõi trong 14 ngày tính từ sau lây nhiễm virus PRRS trên lợn cho thấy: Toàn bộ 6 lợn gây nhiễm đều ốm vào ngày thứ 3-4, bỏ ăn hoặc ăn ít dần, từ sau khi gây nhiễm virus PRRS 9-10 ngày lợn hồi phục dần, không có lợn chết.
Các triệu chứng như: Tai xanh nhạt xuất hiện rồi biến mất, hắt hơi và ho vào ngày thứ 5 sau gây nhiễm, tăng dần ở ngày thứ 7-9 sau đó thuyên giảm.
Lợn kém ăn bắt đầu vào ngày thứ 3-4 sau gây nhiễm, bỏ ăn 1-3 ngày, ăn ít trở lại sau 1 tuần.
Thân nhiệt tăng đến 41-41,5oC vào ngày ngày thứ 4, sốt cao kéo dài 3-5 ngày, da xuất hiện ban đỏ, thở nhanh, thở khó, kèm theo sốt là táo bón xuất hiện và kéo dài 4-6 ngày sau đó.
Như vậy, sau gây nhiễm 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB độc lực trên lợn thí nghiệm, ở cả 2 lô lợn 1 và 2 cho thấy các biểu hiện lâm sàng của lợn mắc PRRS rất điển hình là lợn ốm sốt, bỏ ăn hoặc giảm ăn, phát ban, sưng mí mắt, tai xanh, khó thở, ho, táo bón, vận động lờ đờ, xuất huyết dưới vùng da mỏng. Tuy nhiên khả năng lợn hồi phục dần sau công cường độc của 2 lô khác nhau, lô 1 chậm
hơn lô 2, lô số 1 là 13-14 ngày, lô số 2 là 9-10 ngày từ sau khi gây nhiễm virus PRRS, lô số 1 có 2 lợn sốt cao 42oC và bị co giật. Lô đối chứng số 3, lợn khỏe mạnh, phát triển bình thường, không có biểu hiện lâm sàng của lợn mắc PRRS.
3.1.2. Khả năng tăng trọng của lợn thí nghiệm
Theo dõi khả năng tăng trọng của 3 lô lợn: Lô lợn đối chứng và 2 Lô thí nghiệm sau 14 ngày từ khi gây nhiễm bằng 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB độc lực, kết quả được tổng hợp ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả theo dõi khả năng tăng trọng của lợn
Theo dõi khả năng tăng trọng của lợn thí nghiệm ở lô 1 sau 14 ngày gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY cường độc, lợn gần như không tăng cân, tăng trọng trung bình của lô thí nghiệm là 0,13 kg/lợn, trong đó có 2 lợn giảm cân. Lợn ở lô thí nghiệm số 2 sau 14 ngày gây nhiễm chủng virus PRRS 05TB tăng trọng trung bình mức nhẹ 0,88 kg/lợn, không có lợn giảm cân. Lô đối chứng
Liều tiêm 4 1ml 10 TCID50 Lợn số Khối lượng trước gây nhiễm
virus (kg)
Khối lượng sau gây nhiễm virus
(kg) Tăng trọng từng con (kg) Tăng trọng trung bình (kg) Lô 1 (02HY) 1 8,7 9,0 0,3 0,13 2 9,0 8,8 -0,2 3 9,5 10,2 0,7 4 8,6 8,8 0,2 5 8,5 8,5 0,0 6 9,2 9,0 -0,2 Lô 2 (05TB) 7 8,8 9,5 0,7 0,88 8 8,9 9,8 0,9