Chương 2: đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.2.2.1. Nghiên cứu một số đăc điểm lâm sàng:
* Phương pháp: hồi cứu một số đặc điểm lâm sàng qua hồ sơ bệnh án. Kiểm tra lại một số triệu chứng cơ năng qua hỏi bệnh nhân.
* Nội dung:
+ Tuổi, giới, tuổi mắc bệnh trung bình.
+ Lý do vào viện: có triệu chứng lâm sàng, tình cờ phát hiện.
+ Thời gian chẩn đoán: tính từ khi bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng đến khi được chẩn đoán xác định.
+ Triệu chứng toàn thân: sốt, mệt mỏi, gầy sút nhanh. + Sờ thấy u ở bụng.
+ Triệu chứng do u chèn ép: tắc ruột, bán tắc ruột ( đau, nôn, bí, chướng), tức nặng khó chịu ở bụng, nuốt nghẹn.
+ Các triệu chứng khác: hội chứng nhiễm khuẩn, vàng da tắc mật...
2.2.2.2. Nghiên cứu một số dặc điểm xét nghiệm huyết học, chức năng gan thận.
* Phương pháp: hồi cứu các kết quả xét nghiệm huyết học, sinh hóa ngay khi bệnh nhân mới nhập viện. So sánh kết quả của bệnh nhân với hằng số sinh lý ở người lớn của người Việt Nam (xem mục lục 1).
* Nội dung: nghiên cứu các chỉ tiêu: số lượng hồng cầu, lượng huyết sắc tố, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu, mức glucose, ure, creatinin, SGOT, SGPT, mức bilirubin toàn phần, mức bilirubin trực tiếp.
2.2.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình ảnh
- Đặc điểm hình ảnh siêu âm
* Phương pháp: thu thập các kết quả siêu âm ổ bụng trước điều trị. * Nội dung nghiên cứu:
+ Vị trí u: siêu âm ổ bụng không phát iện được u, siêu âm ổ bụng phát hiện được u ( dạ dày, ruột non, đại tràng, trực tràng, trong ổ bụng).
+ Kích thước u: <2 cm, 2-<5cm, 5 -<10cm, >10cm.
+ Đặc điểm: cản âm của u: tăng âm, giảm âm, âm hỗn hợp, trống âm, âm đồng nhất, âm không đồng nhất, tăng mạch máu, xuyết huyết trong u.
+ Chẩn đoán siêu âm: nghĩ đến GIST, không nghĩ đến GIST - Đặc điểm chụp cắt lớp vi tính
*Phương pháp: thu thập các phim chụp cắt lớp vi tính. Đọc lại các phim chụp cắt lớp vi tính bởi 2 chuyên gia X-quang độc lập. Đối chiếu kết quả với kết quả đọc trước phẫu thuật.
*Nội dung nghiên cứu
+ Vị trí u: chụp cắt lớp vi tính không phát hiến được u, chụp cắt lớp vi tính phát hiện được u ( dạ dày, ruột non, đại tràng, trực tràng, trong ổ bụng).
+ Đặc điểm hình ảnh chụp cắt lớp vi tính của u: mờ đồng nhất, mờ không đồng nhất, ranh giới rõ, ranh giới không rõ, dịch trong u, khí trong u, vôi hóa.
+ Chẩn đoán chụp cắt lớp vi tính: nghĩ đến GIST, không nghĩ đến GIST.
- Đối chiếu đặc điểm siêu âm, chụp cắt lớp vi tính với biên bản mổ và mô bệnh học.
*Phương pháp: thu thập các biên bản mổ và mô bệnh học. Đối chiếu đặc điểm siêu âm, hình ảnh chụp cắt lớp vi tính với biên bản mổ và kết quả mô bệnh học. *Nội dung nghiên cứu:
+ Vị trí: không xác định được, xác định được ( thực quản, dạ dày, ruột non, đại tràng, trực tràng).
+ Kích thước: <2cm, 2-<5cm, 5-<10cm, >10cm. + Cấu trúc: đồng nhất, không đồng nhất, ranh giới.
2.2.2.4. Nghiên cứu một số đặc điểm mô bệnh học:
* Phươg pháp nghiên cứu
- Thu thập các kết quả mô bệnh học. Thu thập các tiêu bản đã nhuộm HE. Đọc lại các tiêu bản nhuộm HE ( nếu cần). Các tiêu bản không rõ được cắt nhuộm lại từ block paraffine theo quy trình:
Cắt ở nhiệt độ 25°C (đảm bảo block cứng).
Độ nghiêng của lưỡi dao đặt và mắt cắt thích hợ là 45°. Nhiệt độ dàn tiêu bản thích hợp không qus 50°C.
Đặt mảnh dán ở 2/3 dưới của lam kính.
Dán mảnh cắt lên lam kính bằng dung dịch albumin 1-2%. + Nhuộm Hematoxylin – Eosin (HE)
Tiêu bản tẩy nến Xylen ×3 lần, 2 phút/lần.
Rửa nước chảy 5 phút.
Nhuộm nhân trong dung dịch hematoxylin nhanh 5-7 phút. Rửa nước chảy 5 phút.
Biệt hóa cồn –acid (acid HCl 0,5% trong cồn 70) trong vài giây.
Rửa nước chảy ít nhất 5 phút (kiểm tra dưới kính hiển vi xem nhân đã nhuộm được chưa. Nếu nhạt quá thì nhuộm thêm, ngược lại ếu sẫm quá thì tẩy tiếp tục trong cồn- acid và nước chảy tiếp 5 phút.
Làm xanh bằng dung dịch lithi carbonat hoặc dung dịch carbonat bão hòa. Rửa nước chảy 5 phút.
Nhuộm bào tương trong eosin từ 3-5 phút. Rửa qua nước.
Loại phẩm thừa trong cồn 95° trong vài giây.
Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối, làm trong bằng Xylen, gắn lamelle bằng Baume Canada.
+ Đọc kết quả bằng kính hiển vi quang học *Nội dung nghiên cứu
+ Vị trí: thực quản, dạ dày, ruột non, đại tràng, trực tràng. + Kích thước n
+ Loại tế bào n + Độ ác tính
2.2.2.5. Nghiên cứu một số đặc điểm HMMD
* Phương pháp: thu thập các kết quả HMMD, các tiêu bản đã nhuộm HMMD. Đọc và cắt nhuộm lại nếu cần
+các Marker sử dụng: sử dụng các marker đẻ chẩn đoán và chẩn đoán phân biệt GIST với các u trung mô ác tính khác ở đường tiêu hóa.
Bảng 2.1: Các dấu ấn dùng để chẩn đoán và chẩn đoán phân biệt GIST
KIT CD34 Nestin SMA Desmin S100 GFAP
GIST + +/- + -/+ -/+ -/+ - Leiomyoma - - - + + - - Leiomyosarcoma -/+ -/+ ? + +/- - - Schawnnama - -/+ + - - + + Undifferentiated sarcoma - - ? -/+ - - -
+ Quy trình nhuộm HMMD ( có thể nhuộm bằng máy hoặc nhuộm thủ công). Quy trình nhuộm thủ công
- Cắt mảnh bệnh phẩm thành các lát cắt 3-4µm, trải phẳng lên lam kính chuyên dụng, ủ qua đêm ở 55-56°C.
- Tiền xử lý tiêu bản với toluene, cồn. Sau đó tiêu bản được tráng qua đệm TBS.
- Bộc lộ kháng nguyên sử dụng phương pháp theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
- Khử enzyme peroxydase nội sinh bằng dung dịch H2O2 3%.
- Ủ mẫu với dung dịch kháng thể thứ nhất đặc hiệu với kháng nguyên đích. - Ủ mẫu với dung dịch kháng thể thứ hai có gắn enzyme ( Envision + Dualink
System).
- Ủ dung dịch tạo màu ( Diaminobenzidine – DAB) cho phản ứng tạo màu diễn ra.
- Phản nhuộm nhân với Hematoxylin.
- Loại nước trong tiêu bản và gắn lamen để quan sát và đánh giá kết quả. - Quan sát và đánh giá kết quả dưới kính hiển vi quang học. Phải đói chiếu với
nhuộm tiêu bản HE để biết vùng cần đọc kết quả là vùng nào. + Âm tính: chỉ có màu xanh của nhân
+ Dương tính: màng tế bào bắt màu vàng nâu. Quy trình nhuộm máy:
- Khởi động máy nhuộm, máy tính đi kèm có phần mềm Ventana và máy in Barcode
- Tạo protocol nhuộm marker tương ứng - In nhãn cho slides
- Dán nhãn và chạy máy - Xử lí sau nhuộm và gắn lam - Đọc tiêu bản và đánh giá
2.2.2.6. Nghiên cứu một số dặc điểm đột biến gene
* Phương pháp: nghiên cứu bằng phương pháp giải trình bằng DNA. Bước 1: tách chiết genomic DNA
+ Mô vùi nến được cắt làm tiêu bản. Đánh dấu trên lam kính vùng mô tổn thương qua soi kính hiển vi quang học.
+ Cạo mô vùng tổn thương vào tube Eppendorf 1,5 ml.
+ Khử nến mô tổn thương: ly tâm 2 lần bằng Xylene, sau đó rử lại bằng ethanol tuyệt đối và đẻ khô.
+ Ủ mô thu được với protein K (Thermo, Mỹ) ở 56°C trong 2 giờ. + Tinh sạch sản phẩm DNA bằng phenol-chloroform (Mỹ).
+ Kết tủa DNA bằng Ethanol tuyệt đối trong muối NH4OAC. (+ Định nồng độ DNA bằng máy spectrophotometer.)
Bước 2: khuếch đại các exon bằng kỹ thuật PCR
+ Thiết kế mồi: các đoạn mồi được thiết kế bằng phần mềm Bioedit 7.1 dựa trên trình tự chuẩn KIT và PDGRFA mang accession number NG_007456 trong GenBank (bảng 2.2).
Tên mồi Trình tự DNA (5’---3’) Exon được khuếch đại Sản phẩm PCR (bp) KIT-9F AGTATGCCACATCCCAAGTG 9 317 KIT-9R CAGAGCCTAAACATCCCCTTA KIT-11F CCAGAGTGCTCTAATGACTG 11 236 KIT-11R ACCCAAAAAGGTGACATGGA KIT-13F CATCAGTTTGCCAGTTGTGC 13 182 KIT-13R CAGCTTGGACACGGCTTTAC KIT-17F GAACATCATTCAAGGCGTAC 17 392 KIT-17R TTTACATTATGAAAGTCACAGG PDGRFA- 12F CTCTGGTGCACTGGGACTTT 12 274 PDGRFA- 12R AAAGGGAGTCTTGGGAGGTT PDGRFA- 18F CCTAGTCGGTCAGAACGT 18 233 PDGRFA- 18R GACCAGTCCGAGTAGGAG + Khuếch đại exon:
Cho vào mỗi tube tổng thể tích 50µl gồm: PCR buffer, dNTP ( 250 µM cho mỗi loại ); 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5µM cho mỗi loại); 1,5 unit Taq™ Hotstart Polymerase ( Takara, Nhật Bản); 20ng genomic DNA.
Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy Gene Amp® PCR system 9000 (Ampplied Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 95°C trong 2 phút, theo sau băng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 95°c trog 10 giây, gắn mồi ở 60°C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 72°𝐶 trong 1 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 72°C trong 5 phút.
Phát hiện sản phẩm PCR bằng điện di trên thạch agarose 2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel documentation (Nhật Bản). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit ( Qiagen, Mỹ) và được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 2%.
Bước 3: giải trình tự chuỗi AND
+ Sản phẩm PCR tinh sạch được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye V3.1 từ Applied Biosystems theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi exon.
+ Phân tích kết quả bằng phần mền bioedit, so sánh với trình tự tham chiều của KIT và PDGRFA mang accession number NG_007456 để chẩn đians tình trạng đột biến gene của các exon.
*Nội dung nghiên cứu: vị trí đột biến (exon), kiểu đột biến ( đột biến điểm, đột biến mất đoạn, chèn đoạn, đột biến phức tạp), đột biến ở mức độ protein.
2.2.2.7. Nghiên cứu mối liên quan giữa một số đặc điểm mô bệnh học và một số đặc điểm đột biến gene
*Phương pháp: tìm mối liên quan giữa một số đặc điểm mô bệnh học và một số đặc điểm đột biến gene
*Nội dung nghiên cứu: đối chiếu đặc điểm vị trí, kích thước, loại tế bào, độ ác tính của u đối với vị trí đột biến, kiểu đột biến và đột biến ở mức độ protein.
2.2.2.8. Nghiên cứu phân bố giai đoạn bệnh và phân tầng nguy cơ tái phát
*Phương pháp:
+ Thu thập các dư liệu để đánh giá giai đoạn bệnh bao gồm: hỏi bệnh sử và khám lâm sang, chụp X-quang tim phổi, siêu âm ổ bụng, soi thực quản-dạ dày, soi đại- trực tràng, chụp cắt lớp vi tính, chụp MRI, siêu âm nội soi, biên bản mổ, kết quả mô bệnh học.
+ Yêu cầu: tất cả các bệnh nhân được hỏi, khám bệnh và được khảo sát dọc ống tiêu hóa (thực quản, dạ dày, ruột non, đại tràng, trực tràng, gan, lách, ổ bụng) bằng ít nhất một phương pháp chẩn đoán hình ảnh. Vị trí, kích thước u, tình trạng hách di căn, độ ác tính dựa trên kết quả mô bệnh học.
*Nội dung: phân chia giai đoạn bệnh theo AJCC ( American Joint Committee On Cancer) ấn bản thứ 7 năm 2010 và phân tầng nguy cơ tái phát theo NIH cải biên. Cụ thể:
Tx: không đánh giá được u nguyên phát. T0: không có bằng chứng u nguyên phát. T1: u<2cm.
T3: 5<u<10cm. T4: u>10cm
N0: không di căn hạch vùng hoặc tình trạng hạch vùng không rõ. N1: di căn hạch vùng.
M0: không có di căn xa. M1: có di căn xa
Gx: không đánh giá độ ác tính.
G1: độ ác tính thấp, tỷ lệ phân bào ≤5/50HPF. G2: độ ác tính cao, tỷ lệ phân bào >5/50HPF.
Bảng 2.3: Phân chia giai đoạn cho GISt dạ dày, mạc nối theo AJCC 2010
Giai đoạn T N M Tỷ lệ phân
bào
Giai đoạn IA T1 hoặc T2 N0 M0 Thấp
Giai đoạn IB T3 N0 M0 Thấp T1 N0 M0 Cao T2 N0 M0 Cao Giai đoạn II T4 N0 M0 Thấp Giai đoạn IIIA T3 N0 M0 Cao Giai đoạn IIIB T4 N0 M0 Cao Giai đoạn IV Bất kỳ T N1 M0 Bất kỳ tỷ lệ Bất kỳ T Bất kỳ N M1 Bất kỳ tỷ lệ
Bảng 2.4: Phân chia giai đoạn cho GIST ruột non, thực quản, đại tràng, mạc treo ruột, phúc mạc theo AJCC 2010
Giai đoạn T N M Tỷ lệ phân bào
Giai đoạn IA T1 hoặc T2 N0 M0 Thấp
Giai đoạn II T3 N0 M0 Thấp Giai đoạn IIIA T1 N0 M0 Cao T4 N0 M0 Thấp Giai đoạn IIIB T2 N0 M0 Cao T3 N0 M0 Cao T4 N0 M0 Cao Giai đoạn IV Bất kỳ T N1 M0 Bất kỳ tỷ lệ Bất kỳ T Bất kỳ N M1 Bất kỳ tỷ lệ
Bảng 2.5: Phân tầng nguy cơ tái phát theo NIH 2002
Mức nguy cơ Kích thước (cm) Tỷ lệ phân bào (/50hpf)
Nguy cơ rất thấp <2 <5
Nguy cơ thấp 2-5 <5
Nguy cơ trung bình <5 6-10
5-10 <5
Nguy cơ cao >5 >5
>10 Bất kỳ
Bất kỳ >10
2.2.2.9. Nghiên cứu phương pháp điều trị
* Phương pháp nghiên cứu: hồi cứu hồ sơ bệnh án tại BVTWQĐ 108 và BV K Trung ương
* Nội dung: chăm sóc giảm nhẹ, phẫu thuật đơn thuần, phẫu thuật + điều trị đích
2.2.2.10. Nghiên cứu thời gian sống thêm toàn thể
* Phương pháp:
+ Tính thời gian sống thêm toàn thể theo WHO. Cụ thể: thời gian sống thêm toàn thể tính từ khi chẩn đoán xác định đến khi tử vong hoặc kết thúc nghiên cứu.
+ Thời điểm bắt đầu nghiên cứu là tháng 01-2010. Thời điểm kết thúc nghiên cứu là tháng 12-2015.
+ Tình trạng bệnh nhân khi kết thúc nghiên cứu: với bệnh nhân còn sống được khám lại. Với bệnh nhân đã tử vong được ghi nhân qua theo dõi hoặc qua liên lạc với thân nhân bệnh nhân.
*Nội dung nghiên cứu: thời gian sống thêm toàn thể tính theo tháng.
2.2.2.11. Nghiên cứu mói tương quan giữa thời gian sống thêm toàn thể vói một số đặc điểm mô bệnh học, đột biến gene, giai đoạn bệnh và mức nguy cơ.
* Nội dung:
+ Theo đặc điểm mô bệnh học: vị trí ( thực quản, dạ dày, ruột non, đại tràng, trực tràng), loại tế bào (hình thoi, dạng biểu mô, hỗn hợp tế bào), độ ác tính (thấp, cao).
+ Theo đặc điểm đột biến gene: vị trí đột biến, kiểu đột biến. + Theo giai đoạn bệnh: Giai đoạn I, II, III, IV.
+ Theo mức nguy cơ: I, II, III, IV.