2.2.1.1. Xác định hàm lợng kim loại nặng: Định lợng hàm lợng kim
loại nặng trong cơ thịt vẹm và trong nớc biện bằng phơng pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử.
Quá trình xử lý mẩu để phân tích tiến hành nh sau: mẫu cơ thịt vẹm xanh sau khi nghiền nhỏ, tiến hành dùng cân phân tích với độ chính xác 0.001g cân mỗi mẫu 3g cho vào chén nung đã chuẩn bị sẵn và tiến hành nung. Quá trình nung trong lị nung đợc tiến hành theo nhiều giai đoạn nhằm hạn chế sự thất thốt mẫu trong khi nung nh sau: lúc đầu chén nung đợc đậy nắp khơng hồn tồn, nhiệt độ của lị nung điều chỉnh từ 160-170oC và giữ nguyên nhiệt độ này trong khoảng từ 2 - 3h, sau đĩ nâng nhiệt độ lên 200oC
và giữ trong khoảng 1h, tiếp tục nâng nhiệt độ lên 300oC từ 1-1,5h và kết thúc nâng nhiệt đến nhiệt độ đến 400oC và giữ đến khi tro hố trắng. Trong quá trình vơ cơ hố mẫu để cho quá trình vơ cơ xảy ra nhanh chĩng ta cĩ thể thêm acid nitric (HNO3) đậm đặc.
Mẫu sau khi đã hố tro trắng hồn tồn dùng acid clohydric 5% cho vào chén nung để hồ tan tồn bộ khống cĩ trong mẫu, sau đĩ rĩt mẫu đã hồ tan vào bình định mức 25ml, tráng lại cốc nhiều lần và dùng dung dịch HCl 5% dẫn tới vạch định mức.
Dung dịch ion chuẩn đợc pha lỗng từ dung dịch gốc (nồng độ 1000mg/l), tuỳ từng kim loại cụ thể và theo tiêu chuẩn tơng đơng sẽ pha nồng độ của dung dịch chuẩn tơng đơng khác nhau.
Các thí nghiệm xác định hàm lợng kim loại nặng đợc đo bằng máy đo AAS (Mỹ).
2.2.1.2. Định tính các lồi vi tảo độc cĩ trong mơi trờng nớc và trong đờng tiệu hố của vẹm xanh
- Mẫu xác định thành phần vi sinh vật phù du trong nớc biển đợc thu bằng vợt vải lới hình chĩp, cĩ mắt lới 20àm, mẫu đợc thu ở cả tầng mặt và tầng đáy. Mẫu thu đợc cho vào các chai NISKIN cĩ dung tích 5 lít, dùng Lugon trung tính để cố định mẫu và vận chuyển về phịng thí nghiệm. Sau đĩ tiếp tục để lắng mẫu qua nhiều giai đoạn trong vịng 48 - 96h trong các ống đong hình trụ, loại bỏ phần nớc phía trên, giữ lại phần mẫu phía dới với thể tích 5-10ml, sau đĩ bổ sung thêm Caloflour với nồng độ 0.5mg/ml. Mật độ tế bào thực vật phù du trong nớc biển đợc xác định theo phơng pháp của UNNESCO (1978) bằng cách sử dụng buồng đếm Sedegwick – Rafter cĩ thể tích 1ml và đếm trên kính hiển vi huỳnh quang đảo ngợc Leica DMLB. Thành phần lồi thực vật phù du đợc phân loại và sắp xếp theo hệ thống phân loại của Hồng Quốc Chơng (1962 & 1963), Shirota (1966), Trơng Ngọc An
(1993), Tay lor (1976), Tomas (1977). Sử dụng kính hiển vi Leica DMLB với pha tơng phản và huỳnh quang để quan sát, định loại các vi tảo độc và sử dụng máy ghi hình kỹ thuật số để chụp ảnh. Việc xử lý hình ảnh thu đợc, thực hiện tại phịng thí nghiệm sinh vật phù du của Viện hải dơng học Nha Trang.
- Mẫu xác định thành phần vi sinh vật phù du cĩ trong đờng tiêu hố của vẹm xanh thơng phẩm đợc tiến hành nh sau: lấy ngẫu nhiên từ 20-30 con vẹm ở các kích thớc khác nhau, tách riêng phần nội quan dùng cho các phân tích quan sát thành phần thức ăn trong nội tạng vẹm. Sau đĩ tách ống tiêu hố của vẹm và quan sát định tính thành phần các loại vi tảo cĩ trong ống tiêu hố của vẹm dới kính hiển vi huỳnh quang theo phơng pháp giống nh xác định hàm lợng vi tảo độc cĩ trong mơi trờng nớc.
2.2.1.3. Phân tích độc tố cĩ trong vẹm xanh thơng phẩm
Vẹm xanh sau khi rửa sạch, tách loại vỏ, phần cơ thị đợc để ráo trên sàng số 10 trong 5 phút và tách riêng phần nội quan dùng cho phân tích độc tố.
Mẫu phân tích độc tố PSP đợc chiết trong HCl 0.1 N; Mẫu phân tích độc tố DSP đợc chiết trong acetone, sau đĩ là methanol và mẫu phân tích độc tố ASP đợc chiết trong methanol 50%. Các bớc chiết rút đợc mơ tả chi tiết trong phơng pháp xác định độc tố của vi tảo theo UNESCO năm 1995 (Manual on Harmful Marine Microalgae, UNESCO, 1995).
Phơng pháp thử nghiệm sinh học độc tố PSP và ASP đợc tiến hành trên chuột theo AOAC (1990) và thử nghiệm sinh học độc tố DSP đợc tiến hành trên chuột theo phơng pháp của Lee và cộng sự năm 1987. Trên cơ sở theo dõi triệu chứng của chuột sau khi tiêm và xác định thời gian chết của chúng, độc tính (MU) sẽ đợc tính tốn và sau đĩ đợc chuyển đổi sang đơn vị hàm l- ợng àg dựa theo đờng cong chuẩn đã biết.
Phơng pháp ELISA để xác định độc tố đợc thực hiện theo Yasumoto (2003) và Sato (2004).
2.2.2. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu
2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm xử lý ion kim loại nặng cĩ trong cơ thịt vẹm xanh
Việc bố trí thí nghiệm để xử xử lý ion kim loại nặng cĩ trong cơ thịt vẹm xanh đợc tiến hành nh sau:
Mẫu vẹm nguyên con
Thời gian và chế độ ngâm
12h 24h
Trong nớc biển sạch Trong nớc biển sạch
Trong nớc biển pha nớc gạo Trong nớc biển pha nớc gạo Nớc biển pha EDTA 1% Nớc biển pha EDTA 1%
Nớc gạo + muối (1%, 2%, 3%) Nớc gạo + muối (1%, 2%, 3%)
Xử lý mẫu
So sánh chọn chế độ ngâm
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sơ bộ xử lý ion kim loại nặng cĩ trong cơ thịt vẹm xanh ở đầm Nha Phu
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ EDTA thích hợp cho xử lý ion kim loại cĩ trong thịt vẹm
Việc bố trí thí nghiệm để xác định tỷ lệ EDTA thích hợp cho xử lý ion kim loại nặng cĩ trong thịt vẹm xanh đợc tiến hành nh sau:
Mẫu vẹm nguyên con
Ngâm mẫu Thời gian 6h 12h 18h 24h Nồng độ 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 1% 1% 1% 1% 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% So sánh chọn chế độ ngâm
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm sơ bộ xử lý hàm lợng ion kim loại nặng cĩ trong cơ thịt vẹm xanh ở đầm Nha Phu
2.2.3. Thiết bị và hố chất sử dụng trong luận văn 2.2.3.1. Các thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận văn
Luận văn đã sử dụng một số thiết bị sau:
- Tủ sấy nhiệt độ Memmer - Đức cĩ thể điều chỉnh tới 150oC.
- Cân điện tử Satorius - Đức, loại 2200g và 220g độ chính xác 10-6 (g)
- Máy nghiền đồng thể tốc độ 10.000 vịng/phút
- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, của hãng Themor Elmental, Mỹ (Hình 2.1)
Hình 2.3. Hình ảnh về máy quang phổ hấp phụ nguyên tử AAS
Hình 2.4. Hình ảnh về kính hiển vi huỳnh quang đảo ngợc Leica DMLB
- Vợt lới vải hình chĩp để thu tảo (Hình 2.5)
Hình 2.5. Hình ảnh về vợt lới vải hình chĩp 2.2.3.2. Các loại hố chất chủ yếu sử dụng trong luận văn
Các loại hố chất: Acid nitric (HNO3), acid sunfuaric (H2SO4), acid clohydric (HCl), Hydroxid natri (NaOH), Natri Tetrahydroboric (NaBH4), Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA) và các loại hố chất khác sử dụng trong luận văn đều là hố chất phân tích của hãng Merck (Đức).
2.2.4. Phơng pháp xử lý số liệu
- Xử lý số liệu nghiên cứu theo phơng pháp thống kê sinh học, mỗi thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, mỗi lần lấy 3 mẫu và kết quả là trung bình cộng của các lần thí nghiệm.
- Số liệu đợc xử lý và vẽ đồ thị trên phần mềm excel với hệ số tơng quan R2 ≥ 0,95.
Chơng 3
kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Xác định hàm lợng ion kim loại nặng trong mơi trờng nớc biển đầm nha phu - khánh hồ