- Sử dụng đõnh gớa 10 microsatellite marker cú tớnh đa hỡnh cao để điều tra bước đầu Cõc bước tiến hănh
- Ly trớch DNA
Phđn tử DNA phục vụ cho yớu cầu phđn tớch PCR được chuẩn bị theo qui trỡnh simplified miniscale. Một mẫu lõ tươi, non (2 cm) được thu vă đặt trong ống nghiệm ly tđm 1,5ml cú đõnh dấu, trong đõ lạnh. Lõ được nghiền trong cối vă chăy (Spot Test Plate -Thomas Scientific) sau khi đờ thớm văo 400 àl dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25mM EDTA, 300mM NaCl and 1% SDS). Nghiền mẫu đến khi dung dịch đệm cú mău xanh lõ cđy. Thớm 400àl dung dịch đệm rồi trộn đều. Chuyển 400 àl lysate văo ống nghiệm cú mẫu lõ ban đầu. Lysate sẽ kớch hoạt phản ứng tõch protein nhờ cho văo 400àl chloroform. Vật thể nổi (supernatant) được chuyển văo ống nghiệm mới (1.5 ml) vă DNA được kết tụ nhờ sử dụng cồn ethanol. Mẫu DNA được lăm khụ nhờ giú vă ngưng kết trong 50àl dung dịch đệm TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0). Chỳng tụi sử dụng aliquot 1àl cho phđn tớch PCR. Mẫu DNA được tồn trữ trong tủ lạnh sđu - 20oC để sử dụng.
Xĩt nghiệm microsatellite
Khuếch đại PCR được thực hiện trong 10mM Tris-HCL (pH 8), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2.1 đơn vị của TAKARA Taq, 4 nmol dNTP, 10pmol primer vă 50ng genomic DNA. Chu kỳ PCR: tõch dđy đụi ở 95oC trong 5 phỳt, theo sau lă 35 chu kỳ 94oC trong 60 giđy, 55oC trong 30 giđy vă 72oC trong 60 giđy. Qỳa trỡnh kĩo dăi dđy sau cựng lă 72oC trong 5 phỳt. Cho thớm văo 13àl dung dịch đệm (98% formamide, 10mm EDTA, 0.025% bromophenol blue, 0.025% xylene cyanol) sau khi PCR. Đa hỡnh trong sản phẩm PCR được phõt hiện nhờ thuốc nhuộm ethidium bromide sau khi điện di trớn 5% agarose gel.
Phương phõp STS marker
Cõc bước tiến hănh như sau:
1. Cõc thănh phần dung dịch dựng thường đặt trong tủ lạnh -20 oC hoặc -80oC
2. Ghi nhờn cẩn thận trớn ống nghiệm 0,5àl hoặc trớn micro tap (một loại đặc biệt dựng để chạy mẫu PCR)
3. Chuyển 10,0 àl của mẫu DNA văo ống nghiệm 4. Chuẩn bị pha dung dịch
Thănh phần Pha nồng độ Phản ứng cho nồng độ àl/mẫu Nước cất PCR buffer dNTP Primer Forward Primer reverse Taq polymerase 10X 4mM 5uM 5uM 5U/àl 1x 200uM 250nM 250nM 0,5U 4,9 2.0 1,0 1,0 1,0 0,1 10.0àl 5. Trộn đều vă ly tđm
6. Dựng pipette lấy 10.0àl cho mỏi phản ứng trong úng nghiệm cú chưõ sẳn DNA 7. Lấy một giot dầu (mineral oil) phủ trớn dung dịch
8. Ly tđm
9. Đặt ốùng nghiệm văo mõy PCR, đúng nấp mõy vă khởi hănh cho mõy hoạt động