2.2.1 Phân lập cur
2.2.1.1 Quy trình phân lập cur
Sơđồ 2.2: Quy trình phân lập cur
2.2.1.2 Kết tinh bột curcuminoid thương phẩm
Mục đích: loại bỏ nhựa và giảm hàm lượng DMC, BDMC và làm giàu hàm lượng cur. Bột curcuminoid Sắc ký cột Tinh thể Kết tinh lại Curcumin tinh
Hệ dung môi: MeOH:H2O Thời gian 24 giờ, 5oC
- Silica gel 60G, 0.063-0.200mm - Dm: Diclometan:eter dầu (90:10)
Hóa chất, nguyên liệu và dụng cụ:
- Hóa chất: MeOH, nước cất.
- Nguyên liệu: Bột curcuminoid thương phẩm.
- Dụng cụ: Erlen, lọc hút chân không, bếp điện, nồi, nhiệt kế 100oC, tủđá.
Phương pháp:
- Kết tinh lần 1:
Cho bột curcuminoid vào erlen, đổ vừa đủ lượng MeOH vào lắc đều ở 50oC cho đến khi hỗn hợp trong, cho nước cất vào hỗn hợp trên (500C) đến khi chuyển sang đục, lắc liên tục khi hỗn hợp trong trở lại thì dừng. Để dung dịch nguội ở nhiệt
độ phòng, để kết tinh ở 5oC trong tủ đá khoảng 24 giờ. Sau đó lấy ra, tiến hành lọc hút chân không. Thu phần trên giấy lọc và tiếp tục kết tinh.
- Kết tinh lần 2 và 3: Tiến hành tương tự như lần kết tinh 1.
2.2.1.3 Sắc ký bản mỏng (TLC)
Mục đích
- Xác định các thành phần có trong bột curcuminoid thương phẩm.
- Xác định hệ dung môi chạy cột để phân lập cur tinh.
Nguyên tắc: Dựa trên sự tương tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau.
Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất
- Nguyên liệu: bột curcuminoid thương phẩm sau khi kết tinh 3 lần.
- Dụng cụ: cột sắc ký, hủ bi, vi quản, bản mỏng silica gel 60G, Merck 20x20cm, đèn cồn, bình sắc ký, kẹp, giấy lọc, máy sấy, giá đỡ.
- Hóa chất: MeOH, aceton, diclometan, nước, H2SO4 10%.
Phương pháp:
Hoạt hóa bản mỏng silica gel bằng cách sấy 1giờở 110oC sau đó để cân bằng trong bình hút ẩm 30 phút.
Kéo ống vi quản bằng ngọn lửa đèn cồn, rửa vi quản 3 lần bằng aceton.
- Chấm mẫu lên bản mỏng
Hòa tan một ít mẫu curcuminoid vào chai bi bằng metanol.
Dùng ống vi quản hút một ít mẫu đã hòa tan trong chai bi chấm lên bản mỏng.
Khoảng cách vết chấm cách bờ dưới 0,7cm hai bờ hai bên 0,5cm và khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau 0,6 cm. Kích thước của vết chấm vừa phải. Vì vậy nên việc lựa chọn dung môi để hòa tan mẫu rất quan trọng.
- Triển khai bản mỏng
Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô.
Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lượt theo các tỷ lệ xác định.
Đặt một tấm giấy lọc vào bình triển khai.
Bão hòa dung môi trong bình triển khai từ 15-20 phút.
Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình, đậy nắp bình lại.
Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cách mép trên của tấm bản mỏng khoảng 0,2cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai.
Sấy nhẹ bản mỏng đểđuổi hết dung môi.
- Phát hiện vết
Qua đèn UV (ở bước sóng λ= 254nm hoặc 365nm).
Qua màu sắc tự nhiên.
Phun thuốc thử H2SO4 10% trong H2O rồi hơ nhẹ trên bếp điện.
Qua hơi Iod.
phù hợp.
2.2.1.4 Sắc ký cột (SKC)
Mục đích: Phân lập các thành phần trong hỗn hợp ban đầu.
- Pha động: Khảo sát trước bằng TLC và chọn hệ dung môi diclometan:eter dầu hỏa (90:10)
- Pha tĩnh: Silica gel 60G, 0.063-0.200mm, Merck.
- Cột thủy tinh Φ =30mm.
- Mẫu được nạp vào cột theo phương pháp nạp mẫu ướt.
Tiến hành
- Bước 1: Chuẩn bị
Sấy silicagel ở 110oC trong 4 giờ, cân bằng ẩm trong bình hút ẩm trong 30 phút. Ngâm qua đêm với dung môi chạy cột.
Cột được rửa sạch, sấy khô, kẹp thẳng góc trên giá, cho bông gòn vào
đáy cột.
- Bước 2: Nhồi cột
Cho từ từ lượng silica gel vào becher chứa sẵn dung môi chạy cột, lượng dung môi vừa đủ sao cho hỗn hợp không quá sệt.
Tiến hành cân bằng cột trong 2-4 giờ.
Bước 3: Cho bột curcuminoid sau khi đã kết tinh 3 lần lên bề mặt silica gel của cột.
- Bước 4: Triển khai cột.
- Bước 5: Thu và kiểm tra các phân đoạn để thu được cur tinh khiết.
2.2.2 Tổng hợp các dẫn xuất imin-curcumin.
2.2.2.1 Tổng hợp 3,5- Difluorophenylhydrazinocurcumin a) Quy trình tổng hợp: a) Quy trình tổng hợp:
Sơđồ 2.3: Quy trình tổng hợp 3,5-DFPHC
b) Phương pháp thực hiện
Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ
- Nguyên liệu: Cur tinh, 3,5-Difluorophenylhydrazin hydrochloride 97% (CTPT: C6H6F2N2 .HCl, M=180,58) Khảo sát hoạt tính sinh học Phân lập Rửa chiết Kiểm tra Sắc kí cột TLC, MS, MNR Dung môi CH3COOC2H5:H2O Imin hóa
Loại dung môi Cô giảm áp
Khuấy trộn hoàn lưu Nhiệt độ 60oC Curcumin 3,5-Difluorophenylhy- drazin hydrochloride Dung môi : CH3OH Điều chỉnh pH ~5 (CH3COONa)
- Hóa chất: Acid acetic, natri acetat, metanol, diclometan, hexan, etyl acetat (Chemsol Vina).
- Dụng cụ: Bình cầu 2 cổ, nhiệt kế 100oC, bếp điện, bộ chưng cất hoàn lưu.
Điều kiện phản ứng:
- Phản ứng xảy ra thích hợp theo tỉ lệ 1:1(mol/mol)
- Khối lượng cur tham gia phản ứng là 200mg
- Khối lượng 3,5- Difluorophenylhydrazin hydrochloride 97% là 100mg
- Nhiệt độ phản ứng 600C.
Tiến hành
- Cho 3,5-Difluorophenylhydrazin hydrochloride (100mg) vào bình cầu hai cổ
và hòa tan bằng MeOH, sau đó điều chỉnh PH~5 bằng natri acetat. Tiếp theo cho cur (200mg) vào lắc đều. Đun hỗn hợp hoàn lưu trên bếp khuấy từ trong điều kiện kín ánh sáng, đây là điều kiện đặc biệt quan trọng nhằm tránh xảy ra một số phản
ứng phụ gây khó khăn trong quá trình phân lập sản phẩm.
- Theo dõi phản ứng và thường xuyên kiểm tra pH, khoảng pH rất quan trọng cho phản ứng xảy ra nhanh hay chậm, luôn luôn giữ pH~5.
- Duy trì ổn định các điều kiện phản ứng và kiểm tra điểm dừng phản ứng bằng TLC hệ dung môi diclometan:etyl acetat (96:4)
c) Xử lí mẫu
Mục đích: Loại bỏ bớt tạp chất sau phản ứng ra khỏi hỗn hợp.
Hóa chất, nguyên liệu và dụng cụ
- Hóa chất: Etyl acetat (Chemsol Vina), nước cất, Na2SO4 khan.
- Nguyên liệu: Hỗn hợp sau phản ứng
- Dụng cụ: Phểu chiết, giá đỡ, bình xịt nước cất.
- Cô quay chân không áp suất thấp nhằm loại dung môi còn lại sau phản ứng. Hòa tan hỗn hợp sau khi cô quay bằng etyl acetat, cho hỗn hợp trên vào phểu chiết, từ từ cho nước vào và lắc đều, sau đó hỗn hợp phân thành 2 lớp, xả van chiết bỏ lớp dưới và lấy lớp etyl acetat phía trên.
- Cho Na2SO4 khan vào lớp etyl acetat nhằm loại nước, cô quay loại bỏ etyl acetat, thu được cao thô hòa tan với diclometan và hấp phụ silica gel, cô quay giảm áp loại dung môi.
d) Phân lập sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột
Phân lập sản 3,5-DFPHC bằng cách chạy cột với nhiều hệ dung môi khác nhau. Qua khảo sát một loạt các hệ dung môi như diclometan:hexan, diclometan:eter dầu hỏa, diclometan:etyl acetat, etyl acetat:eter dầu hỏa, hexan:etyl acetat …. Kết quả cho thấy hệ hexan:etyl acetat có khả năng tách tốt nhất.
Sắc ký cột thô
- Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ
• Hóa chất: Hexan (Chemsol Vina), etyl acetat (Chemsol Vina), silica gel 60G 0,04-0,06mm
• Nguyên liệu: Cao sản phẩm thô sau phản ứng tổng hợp 3,5-DFPHC
• Dụng cụ: cột sắc ký, hủ bi.
- Điều kiện sắc ký cột thô
• Silica gel 60G 0,04-0,06mm, Merck được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ
trước khi nhồi cột.
• Khối lượng silica gel nạp cột: 25g.
• Đường kính trong của cột: 2cm.
• Chiều cao của silica gel trong cột: 16 cm.
• Với hệ dung môi triển khai thích hợp hexan:etyl acetat (80:20)
• Phân đoạn 1: Hủ 1-29: không khảo sát
• Phân đoạn 2: Hủ 30-34 bẩn trên đầu sản phẩm và vết sản phẩm bị
vàng đầu, vết màu xanh phía dưới sản phẩm (λ=365nm).
• Phân đoạn 3: Hủ 35-54 sản phẩm vàng dưới và 1 vết dưới sản phẩm màu xanh (λ=365nm).
Thu phân đoạn 3 làm bay dung môi để khô cân được khối lượng 76mg và hấp thụ silica gel để chạy cột tinh.
Sắc ký cột tinh
- Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ
• Hóa chất: Hexan, etyl acetat, silica gel 60G, 0,04-0,06mm
• Nguyên liệu: Sản phẩm từ sắc ký cột thô ở phân đoạn 3.
• Dụng cụ: Cột sắc ký, hủ bi.
- Điều kiện sắc ký cột tinh
• Silica gel 60G, 0,04-0,06mm, Merck được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ
trước khi nhồi cột.
• Khối lượng silica gel nạp cột là 4g.
• Cột sắc ký: đường kính 1cm, chiều cao silica gel trong cột: 8 cm.
• Hệ dung môi triển khai cột hexan:etyl acetat (90:10)
e) Điều kiện sắc ký bản mỏng (TLC) để kiểm tra quá trình sắc ký cột
- TLC silica gel 60G F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. Bản mỏng 8x3cm, chiều cao triển khai bản mỏng 6cm.
- Hiện màu TLC vết màu tím hoặc màu xanh dưới đèn UV (254nm hoặc 365nm).
- Cho một vết duy nhất khi giải ly với hệ dung môi diclometan:etyl acetat (96:4), phun thuốc thử, hiện hình bằng H2SO4 10%, sấy bản ở 1100C cho một vết vàng cam.
2.2.2.2 Tổng hợp 4-Fuorophenylhydrazinocurcumin a) Quy trình tổng hợp Sơđồ 2.4: Quy trình tổng hợp 4-FPHC b) Phương pháp thực hiện Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ Dung môi CH3OH Chỉnh về PH~5 (bằng CH3COONa) Curcumin Imin hóa Khảo sát hoạt tính - Sắc ký cột
- Dung môi: Etyl acetat:H2O - Cô quay - Khuấy trộn hoàn lưu - Nhiệt độ60oc - TLC, MS, NMR 4-Fluorophenylhydrazin hydrochloride Loại dung môi Rửa chiết Phân lập Xác định cấu trúc
- Nguyên liệu: Cur tinh, 4-Fluorophenylhydrazin hydrochloride 95% (CTPT: C6H7FN2.HCl, M=162,59).
- Hóa chất: Acid acetic, natri acetat, metanol, diclometan, etyl acetat (Chemsol Vina).
- Dụng cụ: Bình cầu 2 cổ, nhiệt kế 100oC, bếp điện, bộ chưng cất hoàn lưu.
Điều kiện phản ứng:
- Khảo sát các tỉ lệ số mol khác nhau giữa cur và 4-Fluorophenylhydrazin hydrochloride thì thấy tỉ lệ phản ứng 1:2 (mol/mol) là thích hợp, với tỉ lệ 1:1 (mol/mol) phản ứng xảy ra rất chậm, thời gian phản ứng kéo dài đến 80 giờ mà vết sản phẩm lại nhạt, trong khi đó sản phẩm phụ sinh ra nhiều nằm ở vị trí trên sản phẩm và phía dưới cur.
- Khối lượng cur tham gia phản ứng là 150mg
- Khối lượng 4- Fluorophenylhydrazin hydrochloride 95% là 149mg
- Nhiệt độ phản ứng 600C .
Tiến hành
- Cho 4- Fluorophenylhydrazin hydrochloride 95% (149mg) vào bình cầu hai cổ và hòa tan bằng MeOH, điều chỉnh pH~5 bằng natri acetat, sau đó cho cur (150mg) vào lắc đều.
- Đun hỗn hợp hoàn lưu trên bếp khuấy từ và bịt kín, tránh ánh sáng là điều kiện đặc biệt quan trọng của phản ứng nhằm tránh xảy ra các phản ứng phụ gây khó khăn trong việc tách sản phẩm.
- Luôn luôn duy trì pH~5. Vì vậy thường xuyên kiểm tra pH để điều chỉnh kịp thời. pH có vai trò quan trọng quyết định đến quá trình phản ứng xảy ra nhanh hay chậm.
- Duy trì ổn định các điều kiện phản ứng và kiểm tra điểm dừng phản ứng bằng TLC hệ dung môi giải ly diclometan:etyl acetat (96:4)
Mục đích: Loại bỏ bớt tạp chất ra khỏi hỗn hợp sau phản ứng
Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ
- Hóa chất: Etyl acetat (Chemsol Vina), nước cất, muối Na2SO4 khan.
- Nguyên liệu: Cao thô 4-FPHC sau phản ứng.
- Dụng cụ: Bình xịt nước cất, phểu chiết, giá đỡ.
Thực hiện tương tự như quá trình xử lý mẫu 3,5-DFPHC.
d) Phân lập sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột
Sắc ký cột thô
- Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ
• Hóa chất: Hexan và etyl acetat (Chemsol Vina), silica gel.
• Nguyên liệu: Cao thô sau phản ứng tổng hợp 4-FPHC
• Dụng cụ: Giá đỡ, hủ bi, cột sắc ký.
- Điều kiện sắc ký cột thô
• Silica gel 60G, 0,04-0,06mm được hoạt hoá ở 110oC, 4 giờ trước khi nhồi cột.
• Khối lượng silica gel nạp cột 25g
• Đường kính cột: 2cm
• Chiều cao của silica gel trong cột: 16cm
• Dung môi triển khai TLC hệ hexan:etyl acetate (90:10, 80:20).
- Sau khi chạy cột thô tách được 3 phân đoạn (hình 3.15)
• Phân đoạn 1: Không khảo sát.
• Phân đoạn 2: Sản phẩm có vết bẩn nằm ngay trên đầu, và 1 vết xanh nằm dưới sản phẩm.
• Phân đoạn 3: Sản phẩm mờ và cur.
Sắc ký cột tinh
Sử dụng phân đoạn 2 để phân lập sản phẩm.
- Hóa chất, nguyên liệu, dụng cụ.
• Hóa chất: Hexan, etyl acetat, silica gel 60G, 0,04-0,06mm
• Nguyên liệu: Phân đoạn 2 của sắc ký cột thô.
• Dụng cụ: Cột sắc ký đường kính 1cm, hủ bi.
- Điều kiện sắc ký cột tinh
• Hấp thụ mẫu với silica gel để khô
• Khối lượng silica gel msilica gel=10g.
• Đường kính cột 0,8cm
• Chiều cao của silica gel trong cột là 7cm
• Hệ dung môi chạy cột là hexan:etyl acetat (90:10)
Sau khi chạy cột tinh ta vẫn không tách được vết bẩn trên đầu sản phẩm và vết xanh dưới sản phẩm. Tiến hành thử nhiều hệ dung môi khác nhau cũng không tách được nên tiến hành sắc ký điều chế (SKĐC).
e) Sắc ký điều chế
Nguyên liệu, hóa chất và dụng cụ
- Nguyên liệu: 4-FPHC thu được từ sắc ký cột tinh.
- Hóa chất: Etyl acetat, diclometan.
- Dụng cụ: Bình giải ly có kích thước 22x1,3x21cm, thước kẻ 20cm, phểu lọc, bút chì.
Điều kiện sắc ký điều chế
- TLC silica gel 60G F254 (Merck) 10x20cm, chiều cao triển khai bản mỏng 8,5cm
- Dùng bút chì vạch nhẹ các mức xuất phát cách mép dưới 1cm và mức tiền tuyến cách mép trên 0,5cm. Chừa hai bên lề mỗi bên 1cm. Chuẩn bị bình giải ly đã pha sẵn 100ml hệ dung môi diclometan:etyl acetat (96:4), đặt 1 tấm giấy lọc dọc theo thành bình có chiều dài bằng chiều dài bình. Đậy nắp bình lại để bảo hòa dung môi ổn định khoảng 20 phút.
Tiến hành:
- Hòa tan 39mg mẫu bằng lượng tối thiểu diclometan (100%).
- Dùng vi quản hút mẫu đã pha sẵn và kéo trên bản mỏng thành một đường dài, đều, dọc theo mức xuất phát. Khoảng 10mg mẫu áp dụng cho một bản mỏng có kích thướt 10x20cm.
- Sấy đuổi dung môi, đặt vào bình giải ly đã chuẩn bị sẵn. Khi dung môi lên
đến mức tiền tuyến, không nên để bản ở lâu trong bình, lấy bản ra khỏi bình giải ly, vì sự khuếch tán và sự bay hơi của dung môi có thể làm các vết vừa tách được sẽ bị
trải dài ra.
- Vết sản phẩm hiện màu xanh dưới đèn UV (λ=365nm). Dùng bút chì vạch khoanh vùng nơi có chứa sản phẩm trên bản. Cắt lấy phần này, cạo lấy lớp silica gel có chứa mẫu, giải hấp với dung môi diclometan (100%). Lọc bỏ silica gel, thu phần dung môi có chứa mẫu và sấy đuổi hết dung môi.
f. Điều kiện sắc ký bản mỏng để kiểm tra quá trình sắc ký cột
- TLC silica gel 60G F254 (Merck) được hoạt hoá ở 110oC, 1 giờ. Bản mỏng 8x3cm, chiều cao triển khai bản mỏng 6cm.
- Hiện màu TLC vết màu tím hoặc màu xanh dưới đèn UV (254nm/365nm).
- Cho một vết duy nhất khi giải ly với hệ dung môi diclometan:etyl acetat (96:4), phun thuốc thử, hiện hình bằng H2SO4 10%, sấy bản ở 1100C cho một vết vàng cam.
2.2.3 Phân tích độ tinh khiết và cấu trúc của các dẫn xuất vừa tổng hợp 2.2.3.1 Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis). (Hình 3.9 và 3.16) 2.2.3.1 Phổ tử ngoại khả kiến (UV-Vis). (Hình 3.9 và 3.16)
Phổ tử ngoại khả kiến được đo bằng máy HACH DR5000 tại phòng thí nghiệm trung tâm lọc Hoá dầu, Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh. Độ phân giải