Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã phát triển các phương pháp thử sinh học về độ nhạy cảm của muỗi và một số côn trùng khác với hóa chất diệt côn trùng [54]. Qua thực nghiệm, người ta thấy rằng trong phương pháp thử sinh học dựa vào tỉ lệ muỗi chết theo thời gian để phát hiện nhũng biến đổi về độ nhạy cảm là tốt hơn so với dựa vào tỷ lệ muỗi chết theo cường độ hóa chất diệt côn trùng. Phương pháp thử sinh học phụ thuộc thời gian đã được cải tiến nhiều lần và hiện nay sử dụng các chai thủy tinh được phủ chất diệt côn trùng và các dung dịch hóa chất diệt côn trùng tẩm trên giấy thấm theo thang chuẩn hoặc là các chất hỗ trợ. Phương pháp này làm đơn giản hóa quá trình thực hiện các thử nghiệm và làm tăng lượng thông tin có thể thu nhập từ một nguồn muỗi giới hạn [30].
1.4.2.2 Phương pháp thử hóa sinh (Biochemical assays) và sinh học phân tử:
Các phương pháp hóa sinh và phân tử có thể phát hiện các cơ chế kháng ở từng cá thể côn trùng, chúng có thể khẳng định tính kháng chỉ với việc sử dụng một lượng nhỏ côn trùng.
* Các phương pháp thử hóa sinh đặc hiệu: đã được phát triển với tất cả các cơ chế kháng đã biết, trừ thụ thể GABA và Na biến đổi [21,28,30]. Sự nhận biết cơ chế kháng giúp xác định phổ kháng chéo, dễ dàng lựa chọn các hóa chất diệt côn trùng thay thế, cho phép vẽ chi tiết các khu vực có các quần thể kháng hóa chất.
* Phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu:
Việc sử dụng rộng rãi những hoá chất Pyrethroid và DDT đã dẫn đến sự phát triển của khả năng kháng quỵ (Kdr) ở nhiều loài côn trùng (theo Liu và cộng sự, 2000; Soderlund và Knipple, 2003) bao gồm Anopheles và Aedes. Việc sử dụng DDT và Pyrethroid trong việc kiểm soát những loài gây hại cho việc
trồng lúa và bông đã đóng góp đáng kể cho sự phát triển tính kháng ở An. gambiae từ miền Tây Châu Phi (theo Elissa và cộng sự, 1993); Martinez-Torres và cộng sự, 1998). Cơ chế phân tử của Kdr được chỉ ra sự khác biệt với cơ chế trao đổi chất [28, 40, 45].
Cổng điện thế của kênh vận chuyển ion Na+ chính là vị trí đích của cả DDT và nhóm Pyrethroid. Đột biến ở gen này có liên quan đến kháng quỵ (Knockdown resistance) Kdr với những hoá chất này ở một vài loài côn trùng trong đó có cả Anopheles gambiae. Đột biến ở alen Kdr có liên quan đến tính kháng gặp nhiều ở côn trùng kết quả là sự thay thế Leucine bằng Phenilalanine ở vị trí S6 đầu kỵ nước của vùng II (Theo Williamson và cs, 1996; Dong, 1997, Jamoz và cs, 1998, Martinez-Torress và cs, 1998, 1999b). Hai sự thay thế luân phiên ở vị trí này cũng liên quan tới việc kháng DDT và nhóm Pyrethroid, việc thay thế leucine bằng histidine cũng liên quan đến việc kháng hoá chất nhóm
Pyrethroid ở Hethiothis virescens (Parte và Taylor, 1997) và sự thay thế leucine bằng serine liên quan đến sự kháng DDT và kháng ở mức độ thấp với permethrin ở Culex pipiens tại Trung Quốc (Martinez-Torress và cs, 1999). Sự thay thế leucine bằng phenilalanine ở vị trí 1014 ở cổng điện thế của kênh vận chuyển Na+ có liên quan với sự kháng hoá chất DDT và permethrin ở rất nhiều loài côn trùng, trong đó có Anopheles gambiae ở Tây Phi. Ở loài An. gambiae ở Kenya thì gen quy định cổng điện thế của kênh vận chuyển Na+ nằm trên vai trái của nhiễm sắc thể số 2 (2L), vị trí 20C. Đây là vị trí của locut mang tính chất đặc trưng chủ yếu xác định tính kháng permethrin [41].
Kháng ngã gục (Kdr) với Pyrethroid là do một sự biến đổi trong quan hệ tương tác giữa hoá chất diệt côn trùng và vị trí liên kết của chúng trên kênh vận chuyển Na+, Kdr hình thành những sự thay thế một hoặc nhiều nucleotit trong
kháng DDT và Pyrethroid ở Ae.aegypti ở 13 địa phương khác nhau trên thế giới và thấy quần thể kháng đột biến kdr với DDT và Pyrethroid tại Semarang - trung tâm Java, Belem ở Brazil và quần thể Long Hòa ở Việt Nam. Quần thể Belem có axit amin valine ở vị trí 923 của exon 19 trong khi 3 quần thể Ae.aegypti khác và
An.gambiae có một axit amin leucine ở vị trí tương tự. Tất cả các quần thể
Ae.aegypti chứa một axit amin leucine tại vị trí 952 và 1 axit amin lysine ở vị trí 961của exon 20 nhưng ở vị trí tương tự của An.gambiae lại là valine và histidine. Quần thể Long Hoà chứa tryptophan ở vị trí 982 của exon 20 trong khi 3 quần thể Ae.aegypti khác và An.gambiae có leucine ở vị trí tương tự. Tuy nhiên, ở vị trí 1011 của exon 20quần thể Belem là methionine, còn 3 quần thể
Ae.aegypti khác và An.gambiae là leucine. Quần thể Thái Lan, vị trí 1016 của exon 21 là glycine trong khi 3 quần thể Ae.aegypti khác và An.gambiae lại là valine [41].
Ở một vài loài côn trùng, hầu hết đột biến Kdr làm một leucine thay thế thành phenylalanine (Leu→ Phe) trên đoạn kị nước S6 của vùng II trên gen quy định kênh vận chuyển Na+(Williamson và cs, 1996; Martinez-Torres và cs, 1998). Tuy nhiên, một sự thay thế thứ hai ở vị trí tương tự (Leu → Ser) đã được tìm thấy ở An. gambiae Đông Phi ( theo Ranson và cs, 2000 ). Cả những đột biến đã được báo cáo ở loài An.sacharovi tại Thổ Nhĩ Kỳ [41].
Những nghiên cứu tính kháng chéo ở vị trí đích đã được tìm thấy trong loài
Ae.aegypti (Hemingway và cs, 1989; Brengues và cs, 2003). Việc phân tích trình tự của cADN của chuỗi xoắn kị nước S6 ở vùng II của sáu quần thể Aedes kháng Pyrethroid đã chỉ ra rằng sự thay thế phổ biến nhất Leu → Phe ở An. gambiae thì chưa gặp trong loài Ae.aegypti [28,41].
Loài muỗi Ae.aegypti kháng hoá chất nhóm Pyrethroid ở Việt Nam là đồng hợp tử do sự thay đổi 2 nucleotit, dẫn đến một đột biến Leu → Trp. Những cá thể loài Ae.aegypti kháng Pyrethroid ở Brazil là đồng hợp tử hoặc dị hợp tử cho cả hai axit amin không liền kề (isoleucine thành methionine và glycine thành valine), sự biến đổi này xảy ra là kết quả đột biến một nucleotit. Những thay đổi này cũng đã được tìm thấy ở những cá thể muỗi từ hai vùng khác nhau ở miền trung nước Mỹ. Những mẫu Ae.aegypti từ Indonesia và Thái Lan đã có một đột biến thay thế valine thành glycine là kết quả của sự thay đổi một nucleotit[41].
Có khoảng 20 trình tự axit amin đơn nhất của gen quy định kênh vận chuyển ion Na+ đa hình đã được xác định liên quan với tính kháng Pyrethroid. Tất cả những đột biến đã được xác định ở muỗi đã được tìm thấy ở vùng II của kênh vận chuyển Na+ .
Giải trình tự ADN vùng II của cổng điện thế kênh vận chuyển ion Na+ xác định kháng đột biến ở muỗi. Tuy nhiên, điều này không thể ứng dụng cho nghiên cứu quần thể. Phương pháp PCR chuẩn đoán đơn giản đã được phát triển (Martinez-Torres và cs, 1998) phương pháp này có khả năng chuẩn đoán nhanh những thay thế phổ biến Leu thành Phe ở muỗi kháng, và những cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định những đột biến khác đã được phát triển (Ranson và cs, 2000; Enayati và cs, 2003). Gen quy định kênh vận chuyển Na+ đã được sử dụng như là một công cụ phân tử để tìm kiếm cấu trúc quần thể An. gambiae tại Mali và Burkina Faso [41].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:
Aedes aegypti Linnaeus, 1762
Ngành chân khớp : Arthropoda
Lớp côn trùng : Insecta
Bộ hai cánh : Diptera
Bộ râu phụ dài : Nematocera
Họ muỗi : Culicidae
Họ phụ : Culicinae
Giống : Aedes Linnaeus, 1762
2.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu:
Nghiên cứu được tiến hành trên muỗi Aedes aegypti thu thập được từ thành
phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa trong thời gian từ 1/12/2009 à 15/3/2010.
2.2.2.1 Phương pháp thu mẫu vật:
Thu thập bọ gậy ( F0 ) trong các dụng cụ chứa nước tại thực địa mang về nuôi trong phòng thí nghiệm với điều kiện nhiệt độ khoảng 230C – 250C và ẩm độ 70% - 80%, cho ăn bằng thức ăn của Viện sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương. Quăng được vớt riêng cho vào lồng, lột xác thành muỗi, muỗi được hút đường gluco 10% sau 2- 3 ngày tuổi và cho hút máu chuột. Sau khi muỗi đẻ trứng, thu trứng chuyển sang một lồng mới. Để trứng nở thành bọ gậy và nuôi bọ gậy phát triển thành quăng, lột xác thành muỗi ( F1 ). Sử dụng muỗi cái (F1) 1-2 ngày tuổi để tiến hành thử kháng với các loại hóa chất.Sau đó được mang về phòng thí nghiệm tách chiết và tiến hành PCR xác định đột biến.
2.2.2.2 Phương pháp thử nghiệm sinh học theo WHO/CDS/CPC/MAL / 98.12[56] :
a.Dụng cụ bao gồm:
• 12 ống nhựa có chiều dài 125 mm, đường kính 44 mm. Trong đó 5 ống
đánh dấu đỏ dùng để cho muỗi tiếp xúc với giấy thử, 2 ống có dấu xanh dùng để theo dõi muỗi đối chứng không có hóa chất diệt côn trùng và có 5 ống có dấu xanh để theo dõi và chọn muỗi trước khi thử và theo dõi sau khi tiếp xúc. Một đầu ống được bịt chặt bằng lưới.
• Giấy sạch cỡ 12x15cm để lót ở phía trong các ống theo dõi.
• 6 đế có ren 2 đầu, giữa có một tấm cửa đẩy qua lại được, có một lỗ đường kính 20mm.
• 24 vòng kim loại trong đó có 12 vòng kim loại để chặn các giấy ở ống theo dõi vào thành ống, và 12 vòng đồng dùng cho thử nghiệm với giấy thử.
• Ống hút thủy tinh đường kính 12 mm được lắp với ống cao su mềm, dài
60 cm để hút muỗi. Các ống thủy tinh đường kính 12mm, dài 20cm hở 2 đầu để chứa muỗi trước khi cho vào ống nghỉ.
• 1 cuộn băng dính, một ít bông không thấm nước, giấy hướng dẫn và mẫu
báo cáo. • Giấy thử :
Giấy tẩm hóa chất diệt côn trùng và giấy đối chứng tẩm dầu do Đại học Sains Malaysia, Penang (Malaysia) sản xuất và cung cấp. Giấy tẩm hóa chất và giấy đối chứng được đóng trong hộp nhựa, mép xung quanh hộp được bao kín bằng băng dính, mỗi hộp đựng 8 tờ giấy. Nồng độ một số hóa chất tẩm trên giấy để sử dụng trong thử nghiệm dánh giá mức độ nhạy cảm của muỗi Aedes aegypti với các hóa chất đó là nồng độ chuẩn do TCYTTG quy định được trình bày trong bảng 02.
Bảng 2.Nồng độ các hóa chất sử dụng trong thử nhạy cảm.
Nhóm hóa chất Tên hóa chất Nồng độ (thời gian tiếp
xúc 60’)
Phốt pho hữu cơ Malathion 5%
Clo hữu cơ DDT 4%
Pyrethroid Deltamethrin 0.05%
Permethrin 0.75%
b.Các bước đánh giá độ nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng của muỗi :
• Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ
- Chuẩn bị 6 ống theo dõi lót giấy sạch, 5 ống tiếp xúc lót giấy tẩm hóa chất và 1 ống chứng lót giấy chứng. Mỗi đầu ống chặn bằng một vòng kim loại, lắp ống theo dõi vào một đầu ren của đế. - Chuẩn bị 12 týp thủy tinh hở 2 đầu ,1 đầu được bịt bông không thấm nước và 12 cục bông không thấm nước để bịt đầu còn lại sau khi thổi muỗi vào týp.
• Bước 2: Bắt muỗi vào ống theo dõi
Dùng ống hút thủy tinh hút nhẹ nhàng muỗi Aedes aegypti cái từ lồng nuôi chuyển vào týp thủy tinh đã chuẩn bị từ trước sau khi thổi muỗi vào dùng cục bông bịt đầu còn lại của týp thủy tinh, mỗi týp chứa 10 muỗi cái. Sau đó thổi muỗi từ týp thủy tinh vào ống theo dõi qua lỗ ở tấm cửa đẩy của phần đế, mỗi ống chứa 20 con. Như vậy mỗi loại hóa chất sẽ thử 100 muỗi và 20 chứng.
• Bước 3 : cho muỗi nghỉ
Sau khi bắt đủ 20 con muỗi cái cho mỗi ống nhựa theo dõi, đặt ống đứng cho muỗi nghỉ ít nhất 1 giờ. Theo dõi và thay thế những muỗi bị thương (gẫy chân, gẫy cánh..) bằng những muỗi khỏe mạnh.
Lắp ống tiếp xúc vào đầu ren còn lại của phần đế. Lúc này ống theo dõi và ống tiếp xúc đối diện nhau nhưng ngăn cách nhau bằng tấm cửa của đế. Đẩy tấm cửa sang 1 bên sao cho vòng hở của cửa đẩy trùng khít với miệng của 2 ống, thổi nhẹ để đẩy muỗi từ ống theo dõi sang ống tiếp xúc. Sau đó đẩy tấm cửa để đóng ống lại, tháo ống theo dõi ra khỏi phần đế và đặt sang bên cạnh. Để ống tiêp xúc theo chiều thẳng đứng, phía có lưới hướng lên trên, trong phòng với điều kiện nhiệt độ không quá 300C, độ ẩm 70% - 80%. Theo dõi và ghi lại số muỗi ngã sau 10 phút, 15 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút.
• Bước 5: Theo dõi trong 24 giờ sau tiếp xúc:
Sau 1 giờ tiếp xúc chuyển muỗi từ ống tiếp xúc sang ống theo dõi. Đặt ống theo dõi dựng đứng phía có lưới lên trên. Đặt một miếng bông ẩm thấm nước đường lên trên lưới. Giữ ống theo dõi 24 giờ ở nơi tĩnh, mát, nhiệt dộ không quá 30oC, độ ẩm 70% - 80%. 24 giờ sau đếm số muỗi chết và số còn sống, con nào không bay được coi như là chết và ghi kết quả vào phiếu theo dõi ( theo mẫu có sẵn ).
• Bước 6: tiến hành tương tự với các loại hóa chất tiến hành thử sinh học.
c.Đánh giá kết quả:
Đánh giá kết quả theo dõi tỷ lệ muỗi chết sau 24 giờ thử nghiệm. Tiêu chuẩn đánh giá kết quả như sau:
- Tỷ lệ muỗi chết từ 98% - 100%: Muỗi nhạy cảm với hóa chất diệt côn trùng đã thử.
- Tỷ lệ muỗi chết < 80%: Muỗi kháng với hóa chất diệt côn trùng thử.
- Tỷ lệ muỗi chết < 95% thì cần số mẫu thử lớn hơn 100 muỗi thì mới có kết luận được.
Tỷ lệ muỗi chết ở lô đối chứng lớn hơn 20% thì kết quả thử nghiệm bị huỷ, còn nếu nằm trong khoảng 5% - 25% thì tỷ lệ muỗi chết sẽ được điều chỉnh bằng công thức Abbott:
Công thức Abbott:
Tỷ lệ muỗi chết = (%muỗi chết thí nghiệm - % muỗi chết đối chứng) x 100
100% - % muỗi chết đối chứng
Chú ý:
- Giấy thử tiếp xúc nhiều nhất 5 lần.
- Giấy thử sau khi sử dụng cất vào hộp, dán băng dính cẩn thận.
2.2.2.3 Phương pháp phân tích ADN:
Hoá chất cho phân tích ADN của hãng Fermantas. Mẫu phân tích đối chứng của Anh.
Tách chiết ADN : tách chiết bằng Chelex 100, mỗi cá thể muỗi Aedes aegypti lấy
6 chân để làm mẫu.
Tiến hành như sau:
• Cho vào mỗi ống nhựa (1,5ml) chứa mẫu muỗi 50μl dung dịch 10%
Chelex 100 rồi đem ly tâm nhanh.
• Dùng chày nhựa nghiền mẫu trong ống nhựa cho đến khi thành huyền
• Thêm vào mỗi ống nhựa 10μl proteinase K (10mg/ml) • Ủ 56oC trong thời gian 1 giờ rồi đem ly tâm nhanh, mixture. • Đun sôi huyền dịch trong 10 phút (sau 5 phút trộn bằng mixture) • Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút.
• Thu dịch nổi chứa DNA (40 μl) và bảo quản ở -20oC.
Kỹ thuật PCR
Phân tích đột biến gen Kdr của muỗi Ae.aegypti phát hiện đột biến tại 2 codon ở vị trí 1011 và 1016 theo phương pháp của K.Saavedra-Rodriguez và cs, (2007)[42]. Thống kê của K.Saavedra-Rodriguez và cs, (2007) cho thấy khả năng đột biến tại 2 codon này như sau [42]:
Codon 1011 Codon 1016
Dạng dại Iso (ATA) Val (GTA)
C.Bengues và cs, 2003 Met (ATG) Gly (GGA)
K.Saavedra-Rodriguez và cs, (2007)
Val (GTA) Iso (ATA)
Các thành phần trong PCR:
• Deoxynucleotide triphotphat (dNTPs): Gồm ddNTP, adNTP,
cdNTP, GdNTP là các thành phần tạo ra sợi DNA mới. Sự không cân bằng về 4 loại dNTP có thể làm giảm hoạt tính của Taq DNA
polymerase. Trong PCR Aedes aegypti ta pha chế dNTPs 2μM cần sử dụng từ dNTPs 100μM ban đầu như sau:
- dNTP ban đầu gồm có: +ddNTP: 100 μM +adNTP: 100 μM +cdNTP: 100 μM +gdNTP: 100 μM - dNTP cần sử dụng gồm có: +ddNTP: 2μM +adNTP: 2μM +cdNTP: 2μM +gdNTP: 2μM - Cách pha chế 2μl ddNTP + 98μl H2O