Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C. Việc xử lí tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.
2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập cácchất chất
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng các phương pháp sắc kí như:
- Sắc kí cột thường (CC) - Sắc kí cột nhanh (FC) - Sắc kí lớp mỏng (TLC)
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
2.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ tử ngoại (UV)
- Phổ hồng ngoại (IR)
- Phổ khối lượng phun mù electron (ESI - MS)
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C – NMR - Phổ DEPT - Phổ HMBC, HSQC, COSY Chương 3 THỰC NGHIỆM 3.1. Thiết bị và phương pháp
3.1.1. Hoá chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Các dung môi được sử dụng là: metanol (CH3ỌH), butanol (C4H9OH), etylaxetat (CH3COOC2H5), axeton (CH3COCH3), nước cất.
3.1.2. Các phương pháp sắc kí
3.1.2.1. Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2mm.
Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm.
3.1.2.2. Sắc kí cột
Sắc kí cột thường sử dụng silicagel cỡ hạt 230 – 400/mesh.
3.2. Dụng cụ và thiết bị
- Nhiệt độ nóng chảy được đo trên kính hiển vi Boetius hoặc trên máy Yanaco MP – S3.
- Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy Aigilent.
- Phổ hồng ngoại IR được ghi trên máy Bruker, dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy MS-Engine-5989-HP. - Phổ 1H-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz. Phổ 13C-NMR, DEPT và phổ 2 chiều HMBC, HSQC ghi trên máy Bruker 125MHz (Viện Hóa học- Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam).
3.3. Nghiên cứu các hợp chất từ cây bọt ếch3.3.1. Phân lập các hợp chất 3.3.1. Phân lập các hợp chất
Mẫu lá cây bọt ếch (Gochidion obliquum Decne.) được thu hái ở Nghệ An vào tháng 5/2008 được TS.Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam định danh, tiêu bản được lưu giữ tại khoa Sinh học, Trường Đại học Vinh. Mẫu lá cây bọt ếch phơi khô (6,3 kg) được xay nhỏ và chiết với metanol (20 L x 3) ở nhiệt độ phòng, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao màu nâu (304 g). Dịch chiết được chiết lần lượt với hexan, etyl axetat và butanol, thu được các cao hexan (11g), etyl axetat (129g), butanol (143g), và phần tan trong nước (21g).
Cao etyl axetat được tách bằng sắc kí cột trên silicagel với dung môi rửa giải hexan và tăng nồng độ của axeton thu được 8 phân đoạn chính. Phân đoạn 3 được sắc kí cột lại trên silicagel với hệ dung môi rửa giải hexan- axeton (15:1, 10:1, 7:1, 5:1) thu được chất 85 (132 mg). Phân đoạn 5 được sắc kí cột lại trên silicagel với hệ dung môi rửa giải hexan-axeton (9:1) thu được chất 86 (12,9 g), chất 87 (6,8 g).
Sơ đồ 3.1: Phân lập hợp chất trong lá cây bọt ếch 3.2.2. Dữ kiện vật lí của các hợp chất
Hợp chất 85: Tinh thể hình kim, màu trắng, đ.n.c 281 - 283oC; UVλmaxEtOHnm (logε):219 (2,73), 250 (2,4), 319 (2,5), 275 (2,68); EI-MS m/z: