- Metanol - Etanol - Benzen - propan-1-ol - axeton - Etyl axetat - axit axetic - H2SO4 - HCl 37% - NaOH - NH4OH 25% - H202 30% - Than hoạt tớnh - Giấy đo pH 3.2.2. Cỏc dụng cụ và mỏy múc cần thiết
- Bỡnh cầu chịu nhiệt 2 lớt, 6 lớt - Ống sinh hàn
- Bỡnh triển khai sắc ký - Ống đong
- Thựng nhựa cú thể tớch 30 lớt - Tủ sấy
- Nồi đun cỏch thủy - Bếp điện - Mỏy lọc chõn khụng - Phễu Bucnơ - Thuyền tỏn vỏ tụm - Cõn kỹ thuật - Rổ nhựa - Vải lọc - Giấy lọc
- Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trờn bản mỏng cú đế nhụm đó trỏng sẵn với chất hấp phụ là silicagel 60 F254 Merck, cú độ dày 0,2 mm, triển khai với hệ dung mụi là: propan-1-ol – EA – H20 – NH4OH 25% (40:30:20:10)
- Phổ hồng ngoại được ghi dưới dạng viờn nộn KBr trờn mỏy FT-IR Impact 410. Phổ được đo tại Viện Húa học (Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam)
- Phổ khối lượng được ghi trờn mỏy LC/MS Agilent series 1100. Phổ được đo tại Viện Húa học (Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam)
- Định lượng hàm lượng nitơ trong chitosan bằng phương phỏp Kjeldahl tại Viện kỹ thuật Húa sinh, Tổng cục Kỹ thuật, Bộ Cụng an.
- Nhiệt độ núng chảy được đo trờn mỏy Boetius (Đức) (Viện Kỹ thuật Húa sinh, Tổng cục Kỹ thuật, Bộ Cụng an).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H_NMR và 13C_NMR. Phổ được đo tại Viện Húa học (Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam)
3.3. Thực nghiệm và kết quả:
3.3.1. Điều chế chitosan
Lần lượt tiến hành 2 phương phỏp:
- Deaxetyl húa vỏ tụm ở nhiệt độ 100oC - Deaxetyl húa vỏ tụm ở nhiệt độ thường
Sơ đồ 3.1: Deaxetyl húa vỏ tụm ở nhiệt độ 100oC
Tiến hành điều chế chitosan ở nhiệt độ 100oC
Bước 1: Loại canxi bằng dung dịch HCl 10%
- Cho vào thựng nhựa cú thể tớch vào khoảng 30 lớt: 1kg vỏ tụm đó tỏn nhỏ và 10 lớt dung dịch HCl 10% (tỷ lệ vỏ tụm / HCl 10% là 1W/10V) khuấy đều.
Chỳ ý: Khụng để dung dịch trào ra vỡ cú bọt khớ CO2 bay ra. Để yờn 12 giờ thỉnh thoảng khuấy.
Vỏ tụm sấy khụ tỏn nhỏ
Khử canxi, muối vụ cơ
Rửa trung tớnh pH = 7
Rửa trung tớnh pH = 7 Sấy khụ
Khử protein và deaxetyl húa
Loại chất màu + NaOH 40% to= 100oC t = 5 giờ + H2O2 3% t= 6 giờ HCl 10%, t= 12 giờ Rửa sạch bằng nước Chitosan Sấy khụ
- Lọc chõn khụng qua phểu Bucnơ và rửa với nước cho tới khi nước lọc cú phản ứng trung tớnh (thử với giấy đo pH).
- Để rỏo nước trong khụng khớ. Sau đú cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 80 – 100oC - Cõn được 280g vỏ tụm đó loại canxi và muối vụ cơ
Bước 2: Điều chế chitosan – kết hợp cả 2 giai đoạn loại protein và khử nhúm axetyl
- Cho 280g vỏ tụm đó loại canxi và muối vụ cơ ở trờn và 2800ml NaOH 40% (1W/10V) vào cốc thủy tinh chịu nhiệt cú thể tớch V = 5000ml.
- Đun núng ở nhiệt độ 100oC trong 5 giờ, thỉnh thoảng khuấy và cho thờm nước cho đủ thể tớch là 2800ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Để nguội, lọc và rửa với nước cho tới khi nước lọc cú phản ứng trung tớnh (thử với giấy đo pH)
- Làm khụ trong khụng khớ rồi sau đú sấy khụ ở nhiệt độ 80 – 100oC - Cõn được 95g chitosan thụ
Bước 3: Loại màu bằng H2O2 3%
- Cho 95g chitosan thu được ở trờn ngõm vào dung dịch H2O2 3% trong 6 giờ. - Lọc và rửa sạch bằng nước
- Làm khụ trong khụng khớ rồi sau đú sấy khụ ở nhiệt độ 80 – 100oC. - Cõn được 82g chitosan
- Lặp lại thớ nghiệm tương tự như trờn 3 lần
+ Lần thứ 2: 1kg vỏ tụm thu được 85g chitosan + Lần thứ 3: 1kg vỏ tụm thu được 80g chitosan Lượng chitosan trung bỡnh thu được: 82 85 80 82,3
3
+ + =
g
Sơ đồ 3.2: Deaxetyl húa vỏ tụm ở nhiệt độ thường
Tiến hành điều chế chitosan ở nhiệt độ thường - Nguyờn liệu: 1kg vỏ tụm khụ tỏn nhỏ
- Khử canxi bằng dung dịch HCl 10% như ở trờn
- Khử protein và deaxetyl với dung dịch NaOH 40%. Trong thời gian là 10 ngày ở nhiệt độ thường , thỉnh thoảng khuấy.
- Sau đú tiếp tục tiến hành như ở cỏc lần trước thu được 80g chitosan . Hiệu suất so với vỏ tụm khụ 8%
Nhận xột: Hiệu suất chitosan thu được khi tiến hành ở nhiệt độ 100oC trong 5 giờ và ở nhiệt độ thường trong thời gian 10 ngày là gần bằng nhau.
H% = 8,23% ở nhiệt độ 100oC
Vỏ tụm sấy khụ tỏn nhỏ
Khử canxi, muối vụ cơ
Rửa trung tớnh pH = 7
Rửa trung tớnh pH = 7
Sấy khụ Khử protein và deaxetyl húa
Loại chất màu + NaOH 40% to thường t = 10 ngày + H2O2 3% t= 6 giờ HCl 10% t= 12 giờ Rửa sạch bằng nước Chitosan Sấy khụ
H%= 8% ở nhiệt độ thường
Bảng 3.2: Chỉ tiờu kỹ thuật của sản phẩm chitosan điều chế
Độ ẩm% 9 – 10,5
Hàm lượng tro % 1,4 – 1,8
Màu sắc Trắng ngà
Độ deaxetyl húa % 74,7 – 79,6
Hàm lượng chất khụng tan % 0,9 – 1,15 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lượng nitơ ở mẫu chitosan tiến hành ở to
= 100oC (%)
Độ deaxetyl húa (DD%)
8,25 79,6 Lượng nitơ ở mẫu chitosan tiến hành ở
nhiệt độ thường
Độ deaxetyl húa (DD%)
8,15 74,7 Hiệu suất trung bỡnh % so với vỏ tụm
khụ
H% = 8,23% ở nhiệt độ 100oC trong thời gian 5 giờ
H%= 8% ở nhiệt độ thường trong thời gian 10 ngày
Tuy nhiờn, do kinh phớ hạn hẹp và thời gian thực hành ngắn nờn cú một số chỉ tiờu khụng kiểm tra được như:
- Độ nhớt của sản phẩm
- Đo trọng lượng phõn tử của chitosan
Phổ hồng ngoại (IR) của chitin và chitosan
So sỏnh phổ hồng ngoại (IR) của chitin và chitosan ta nhận thấy cỏc đỉnh hấp thụ ở vựng 1566 cm-1 (nhúm NH-CO) của chitin (Hỡnh 3.1) biến mất khi chitin bị deaxetyl húa thành chitosan (Hỡnh 3.2)
Hỡnh 3.2: Phổ hồng ngoại của chitosan
Phổ 1H NMR của chitosan chuẩn được thể hiện trong hỡnh 3.4. Cỏc tớn hiệu tõm tại δ≅ 2.00 ppm tương ứng với hydrogen của methyl thuộc nhúm axetamido. Cỏc tớn hiệu quan sỏt được giữa 3,10 và 2,90 ppm tương ứng với hydro ngoại quan đến cỏc vũng glucosamin C2, trong khi cỏc tớn hiệu giữa 3,30 và 4,00 ppm tương ứng với hydrogen ngoại quan đến cỏc nguyờn tử cacbon C3, C4, C5 và C6 của glucopyrano mà là ngoài vũng. Cỏc hydro ngoại quan đến cacbon anomeric (C1) phỏt cỏc tớn hiệu trong khoảng 4,40 <d <5,00.
Hỡnh 3.3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H NMR của chitosan chuẩn
Hỡnh 3.4: Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn1H của chitosan điều chế
Phổ 13C NMR của chitosan chuẩn (hỡnh 3.6) cho thấy tớn hiệu tại 177,9 ppm và tại 25 ppm, tương ứng với cỏc cacbon cacbonyl của -COCH3 và cacbon methyl (CH3). Những tớn hiệu này cú cường độ ớt hơn so với cỏc tớn hiệu khỏc, mặc dự mức độ trung
bỡnh của axetylation của mẫu khụng phải là nhỏ. Thật vậy, cỏc nguyờn tử cacbon khỏc nhau cú thời gian thư gión rất khỏc nhau và việc thu lại của quang phổ khụng phải là tối ưu hoỏ để cho phộp phõn tớch định lượng. Cỏc tớn hiệu tại 101,3 ppm được giao cho cỏc hydro carbon ngoại quan để C1 của chitosan và cỏc tớn hiệu trong 59,6 ppm , 73,1 ppm , 81,1 ppm, 78,6 ppm và 64 ppm tương ứng nguyờn tử cacbon C2, C3, C4, C5 và C6 của glypyrano ( Hỡnh 3.6).
Hỡnh 3.5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn13C NMR của chitosan chuẩn
Hỡnh 3.6: Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C-NMR của chitosan
3.3.2. Điều chế glucosamin clorhydrat từ chitin và chitosan
3.3.2.1. Điều chế glucosamin clorhydrat từ chitin:
- Cho vào bỡnh cầu cú thể tớch 2 lớt, cú lắp ống sinh hàn: 80 g chitin và 400ml HCl 37%.
- Đặt bỡnh cầu vào nồi cỏch thủy, đun tới nhiệt độ 95 – 100oC, thời gian thủy phõn là 3 giờ
- Để nguội, lọc
- Rửa cặn bằng 50ml nước
- Loại cặn, dung dịch lọc đem cất để loại bớt axit - Khử màu dung dịch bằng than hoạt tớnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lọc loại than, trung hũa dịch bằng NaOH 10% cho tới pH trung tớnh - Cụ dung dịch cho tới khi trờn bề mặt xuất hiện một lớp vỏng.
- Để nguội và làm lạnh ở nhiệt độ từ 0-2oC trong thời gian 2 giờ thu được glucosamin clorhydrat kết tinh
- Lọc lấy tinh thể glucosamin clorhydrat - Nước lọc lại đem cụ và kết tinh tiếp
- Gộp cả 2 lần kết tinh, rửa sản phẩm bằng nước lạnh sau đú bằng EtOH - Làm khụ trong khụng khớ sau đú cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 60oC. - Thu được 30,8 g glucosamin clorhydrat
- Hiệu suất: H% = 30,8*100
80 = 38,5% đối với chitin
3.3.2.2. Điều chế glucosamin clorhydrat từ chitosan:
Làm lại thớ nghiệm tương tự như trờn với 80g chitosan thu được 33,5g glucosamin clorhydrat.
Hiệu suất: H% = 33,5*100
80 = 41,8% đối với chitosan
Nhận xột :Hiệu suất glucosamin clorhydrat thu được khi tiến hành từ. Chitosan cao hơn từ chitin
H% = 38,5% từ chitin H%= 41,8% từ chitosan
3.3.2.3. Phõn tớch glucosamin clorhydrat
● Sắc ký lớp mỏng: (Hỡnh 3.7)
- Chất hấp phụ: Kieselgel 60 F254 (Merck)
- Dung mụi: propan-1-ol – Etyl axetat – H20 – NH4OH 25% (40:30:20:10)
- Thuốc thử: 2ml anisaldehyt + 2ml H2SO4 đặc và 100ml EtOH (cho vào tủ lạnh, pha chế trước khi dựng)
- Trị số Rf của mẫu chuẩn: Rf = 3,5/5 - Trị số Rf của mẫu điều chế: Rf= 3,4/5
Như vậy, trị số Rf của mẫu chuẩn và mẫu điều chế cú Rf tương đương nhau
Hỡnh 3.7 – Sắc đồ của glucosamin clorhydrat
1- glucosamin clorhydrat điều chế 2- glucosamin clorhydrat chuẩn
3.3.3. Kết quả nghiờn cứu sản xuất chitosan theo phương phỏp húa học ● Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại của glucosamin clorhydrat cú cỏc đỉnh hấp thụ ở cỏc số súng 3298 cm-1 của nhúm OH và NH. Đỉnh hấp thụ ở vựng 2948-3098 cm-1 đặc trưng của nhúm CH2.
Phổ hồng ngoại của glucosamin clorhydrat điều chế (Hỡnh 3.8) được so sỏnh với mẫu chuẩn (Hỡnh 3.9). Ta nhận thấy cỏc pic của mẫu chuẩn và mẫu điều chế cú độ trựng lặp, khẳng định mẫu glucosamin clorhydrat điều chế cú độ tinh khiết cao
● Phổ khối (LC/MS) (Hỡnh 3.10)
Phổ khối của glucosamin clorhydrat điều chế cú pic 214,4 tương với trọng lượng phõn tử của hợp chất này
C6H13NO3,HCl = 215,63 cũng cú M-1 = 214,4
Hỡnh 3.10: Phổ khối của glucosamin clohydrat điều chế
● Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR và 13C-NMRcủa glucosanmin clohydrat
Hỡnh 3.12: Phổ 1H-NMRcủa glucosanmin clohydrat (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT LUẬN
Đề tài đó đạt được một số kết quả như sau:
1) Đó phõn lập được chitin từ vỏ tụm sau khi đó loại canxi và protein, đạt hiệu suất trung bỡnh là 28% so với vỏ tụm khụ.
2) Điều chế được chitosan từ chitin theo 2 phương phỏp: - Phương phỏp 1: Xử lý 1 lần kiềm ở nhiệt độ thường - Phương phỏp 2: Xử lý 1 lần kiềm ở nhiờt độ 100oC
Kết quả: Hiệu suất của 2 phương phỏp gần tương đương nhau chỉ cú thời gian xử lý kiềm khỏc nhau.
- Ở nhiệt độ 100oC thời gian deaxetyl là 5 giờ - Ở nhiệt độ thường phải mất 10 ngày
3) Đó dựng H2O2 3% để loại màu của chitosan.
- Sản phẩm cho màu trắng hơi vàng nếu xử lý với H2O2 3% trong 6 giờ. - Sản phẩm cho màu trắng nếu xử lý với H2O2 3% trong 12 giờ.
4) Chất lượng của chitosan đó được kiểm tra theo cỏc chỉ tiờu: - Độ hũa tan trong axit axetic 1%.
- Định lượng nitơ để xỏc định độ deaxetyl húa - Độ ẩm
- Độ tro
- Đo phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H và 13C chitosan điều chế được đạt tiờu chuẩn của chitosan thường cú ở trờn thị trường
5) Đó điều chế glucosamin clorhydrat bằng phương phỏp thủy phõn chitin hoặc chitosan bằng HCl đậm đặc (37%). Hiệu suất đạt được là 38,5% so với nguyờn liệu là chitin, 41,8% so với nguyờn liệu là chitosan.
6) Đó kiểm tra độ tinh khiết của glucosanmin clorhydrat bằng cỏc phương phỏp: Đo độ chảy, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H và 13C, phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng. Cỏc số liệu phõn tớch đều phự hợp với tài liệu tham khảo và mẫu chuẩn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. TIẾNG VIỆT:
[1] Trịnh Đức Hựng và cộng sự, 2003, Ảnh hưởng của cấu hỡnh chitin đến sự phõn bố mật độ điện tử trờn nguyờn tử nitơ, khả năng hấp thụ tạo phức của chitin và hoạt tớnh xỳc tỏc của phức kim loại – Chitin trong phản ứng oxy húa Na2S bằng oxy phõn tử. Tạp chớ húa học, 41(1)84-87.
[2] Lờ Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Ngọc Tỳ, 2003, Khảo sỏt động học phản ứng deaxetyl húa chitin thành chitosan ở nhiệt độ thường. Tạp chớ húa học, 41(3)54-60.
[3] Trần thị Luyến, Huỳnh Huy Bảo, Hoàn thiện quy trỡnh sản xuất chitin – chitosan và chế biến một số sản phẩm cụng nghiệp từ phế liệu vỏ tụm, cua. Mó số B.98-33-23. Đề tài cấp Bộ, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang, Bộ Giỏo dục và Đào tạo năm 2000.
[4] Lờ Trung Toàn và cộng sự, Nghiờn cứu sản xuất glucosamin sulfat làm thuốc điều trị thoỏi húa xương khớp, Hội nghị khoa học và cụng nghệ Húa dược toàn quốc lần thứ nhất – Hà Nội 19/12/2008, 183 – 187.
[5] Trần Thị Luyến, thỏng 5/2004, Bỏo cỏo tổng kết dự ỏn sản xuất thử nghiệm cấp Bộ sản xuất chitin – chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản (vỏ tụm, vỏ ghẹ) MS B-2002-33-01-DA – Trường Đại học thủy sản Nha Trang, Bộ Giỏo dục và Đào tạo.
[6] Nguyễn Đỡnh Thành, Đặng Như Tại, Bựi Ngọc Linh, Gúp phần tổng hợp một số dẫn xuất chứa dị vũng thơm thiazol và benzothiazol của 2-axetyl-α-D- glucosamin. Hội nghị Khoa học và Cụng nghệ Húa hữu cơ toàn quốc lần thứ III, 161 – 164.
[7]. Nguyễn Thị Huệ, Bựi Thị Huyền, Nghiờn cứu phản ứng thủy phõn chitosan bằng axit hữu cơ – Hội nghị Húa học Việt Nam- Phõn hội Húa hữu cơ, 210-213
[8] Trần Đại Lõm, Vũ Đỡnh Hoàng, 2006, Nghiờn cứu phõn lập chitin và tổng hợp glucosamin sulfat natri clorua từ vỏ tụm, Tạp chớ phõn tớch Húa lý và Sinh học, 11 (3) 57-60.
[9] Trần Thỏi Hũa, 2005, Nghiờn cứu cỏc yếu tố ảnh hưởng đến quỏ trỡnh deaxetyl húa và cắt mạch chitin để điều chế glucosamin, Tạp chớ khoa học – Đại học Huế, (27) 1-6
[10]. Lưu Văn Chớnh và cộng sự, 1993, Hoạt tớnh khỏng viờm của cỏc muối glucosamin. Tạp chớ Dược học, số 4/2003 .
chỗng viờm cấp về tỏc dụng giảm đau tại chỗ của chitosan trờn thực nghiệm,
Tạp chớ Dược học, (7) 18-19.
[12]. Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Tỵ, 2000, Nghiờn cứu tỏc dụng tăng sinh collagen của chitosan trong điều trị bỏng thực nghiệm, Tạp chớ Dược học, (9)20-22.
[13]. Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Bỡnh, Nguyễn Văn Huệ, 2002, Nghiờn cứu diễn biến mụ học tại chỗ vết thương bỏng, được điều trị bằng kem chitosan trờn thực nghiệm, Tạp chớ Dược học, (4) 24-26. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[14]. Nguyễn Thị Huệ, Lõm Ngọc Thụ, Nguyễn Văn Hoàn, 2002,Nghiờn cứu tỏc dụng của cỏc chất điều hũa sinh trưởng từ chitin đối với giảm cõn, Tạp chớ Húa học, 40 (1)1-5
[15] Đỗ Văn Nam và cụ̣ng sự, 2005, Nghiờn cứu đỏnh giỏ hiện trạng mụi trường cỏc cơ sở chế biến thủy sản, đề xuất cỏc giải phỏp quản lớ. Viện nghiờn cứu Hải