Rễ cây vối sau khi làm khô cân đợc 53 kg, sau đó đợc ngâm trong metanol trong thời gian 45 ngày. Lọc dịch chiết và cho bay hơi tự nhiên thu đợc cao metanol (1,1kg).
Lấy một phần cao metanol đợc hoà tan trong nớc cất sau đó lần lợt chiết với các dung môi n-hexan, cloroform, etylaxetat, butanol và cho bay hơi tự nhiên đợc các cao n-hexan (30g), cao cloroform (56g), cao etylaxetat (40g), phần dịch chiết butanol và phần cặn. Cao cloroform trộn đều với silicagel theo tỉ lệ 1 : 1 rồi cho vào cột sắc ký đã đợc nhồi bằng pha tĩnh là silicagel cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (254 – Merck). Tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là cloroform : metanol với tỉ lệ tăng dần độ phân cực thu đợc các phân đoạn (mỗi phân đoạn 30 ml), sau đó cất thu hồi dung môi một phần rồi cho bay hơi tự nhiên thu đợc các phân đoạn tơng ứng.
Sau khi cho dung môi vào rửa giải thấy trên cột xuất hiện bốn khoảng màu. Dới cùng có màu trắng sữa, ở giữa có màu đỏ nâu, tiếp theo có màu vàng nhạt và trên cùng có màu nâu đen.
Hình 2. Cột sắc ký cho rễ cây vối
Tại phân đoạn 25 xuất hiện một chất rắn màu hồng nhạt với một lợng lớn. Thử hoà tan trong n-hexan thấy màu hồng tan trong n-hexan rất nhiều nên n-hexan đợc dùng để rửa chất bẩn nhiều lần. Sau khi đợc rửa nhiều lần với n- hexan, chất rắn đợc thử hoà tan trong axeton thì thấy tan rất ít trong axeton lạnh nhng tan gần hết trong axeton nóng nên axeton đợc dùng làm dung môi kết tinh và thu đợc một chất rắn màu trắng có tinh thể hình rẽ quạt kí hiệu là A.
Tại phân đoạn 247 xuất hiện một chất rắn màu vàng nhạt với một lợng lớn. Thử hoà tan trong n-hexan, axeton thấy chất bẩn tan trong n-hexan và axeton rất nhiều nên n-hexan, axeton đợc dùng để rửa chất bẩn nhiều lần. Sau khi đợc rửa nhiều lần với n-hexan, axeton chất rắn đợc kết tinh dung môi metanol và thu đợc một chất rắn màu trắng kí hiệu là B.
Sơ đồ tách các hợp chất từ rễ cây vối
Mẫu khô (53 kg)
Bã mẫu Cao metanol
Cao n-hexan Cao cloroform Cao etylaxetat Dịch chiết butanol Hệ dung môi 98 : 2 Hợp chất A Hợp chất B Hệ dung môi 65 : 45
Ngâm trong metanol 45 ngày
Lọc dịch chiết và cho bay hơi tự nhiên
Hoà tan vào nước. Chiết với các dung môi và cho bay hơi tự nhiên n-hexan cloroform etylaxetat butanol
Nhồi cột
Cấu trúc các hợp chất A, B đợc xác định bằng các phơng pháp phổ : - Phổ khối lợng (EI-MS)
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H-NMR - Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C-NMR - Phổ DEPT
(Đo tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).