Lọc dịch chiết và cho bay hơi tự nhiên
hexan clorofom etylaxetat butanol
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân lập các chất từ hoa cây sim
Bã mẫu cao
metanol
Cao hexan Cao
etylaxetat Cao Clorofom Dịch chiết butanol Hợp chất A BHợp chất (5kg) Hệ dung môi 80 : 20 Hệ dung môi 60 : 40 Nhồi cột
Rửa giải bằng dung môi CHCl3 -MeOH
Chiết với các dung môi và cho bay hơi tự nhiên Hòa tan vào nớc
Sau khi cho dung môi vào rửa giải, trên cột xuất hiện 5 khoảng màu, dới cùng là khoảng màu màu trắng sữa, tiếp đến có màu trắng đục, ở giữa có màu vàng nhạt, tiếp theo là khoảng màu đỏ nâu, trên cùng xuất hiện màu nâu đen.
Tại phân đoạn 110 tơng ứng với hệ dung môi 80 : 20 xuất hiện một chất rắn màu trắng đục. Ban đầu chúng tôi dùng hexan để rửa chất bẩn, tìm các dung môi kết tinh chúng tôi đã lựa chọn đợc hệ dung môi cloroform- metanol với tỷ lệ 8 : 2. Tại hệ dung môi này, ở trạng thái lạnh hầu nh chất rắn không tan, nhng khi đun nóng thì chất rắn này tan hoàn toàn. Thực hiện kết tinh nhiều lần đã thu đợc một chất sạch dạng tinh thể màu trắng, ký hiệu là chất A.
Tại phân đoạn 190 tơng ứng với hệ dung môi 60- 40 có một lợng nhỏ chất rắn màu trắng xuất hiện, dùng axeton để kết tinh nhng khi đun nóng không thấy tan nên chúng tôi sử dụng axeton làm dung môi rửa chất bẩn. Sau đó sử dụng metanol để kết tinh đã thu đợc một chất sạch có dạng bột màu trắng, ký hiệu là chất B.
2.2.2.2. Xác định cấu trúc của hợp chất
Để xác định cấu trúc hóa học của các chất thu đợc phải sử dụng các phơng pháp phổ để khảo sát.
- Phổ khối MS
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR và phổ DEPT
kết quả và thảo luận
3.1. xác định cấu tạo của hợp chất A (tdh 23)
Từ các số liệu phổ MS, 1H - NMR, 13C- NMR, DEPT so sánh với phổ chuẩn đã xác định đợc cấu trúc của hợp chất A nh sau:
3.1. 1. Phổ MS (hình 3.1)
Phổ MS cho pic [M+1] bằng 456,9 nên suy ra phân tử lợng của hợp chất A bằng 456 tơng ứng với công thức phân tử C30H48O3
3.1.2. Phổ 1H - NMR (hình 3.2 và 3.3)
Phổ 1H – NMR của hợp chất A có những tín hiệu cộng hởng nh sau:
Tín hiệu cộng hởng của các proton vinylic H29a và H29b có độ dịch chuyển hóa học tơng ứng δ= 4,72 ppm và δ= 4,59 ppm
Proton của nhóm – CHOH (H3) có độ dịch chuyển hóa học δ= 3,17 ppm (dd) J1 = 11Hz và J2 = 4,5 Hz
Proton H19 có độ dịch chuyển hóa học δ= 2,99 ppm
Các proton của 6 nhóm metyl có độ dịch chuyển hóa học tơng ứng nh sau
δ= 0,95 ppm (s) (3H23) δ= 0,74 ppm (s) (3H24) δ= 0,81 ppm (s) (3H25) δ= 0,93 ppm (s) (3H26) δ= 0,98 ppm (s) (3H27) δ= 1,68 ppm (s) (3H30)
3.1.3. Phổ 13C- NMR (hình 3.5)
Phổ13C- NMR của hợp chất A có những tín hiệu đặc biệt nh sau:
Độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử cacbon của nhóm – COOH (C28)
δ=178,96 ppm
Các nguyên tử cacbon của liên kết đôi có độ dịch chuyển hóa học tơng ứng nh sau:
δ=109,47 ppm (C29) δ= 150,61ppm (C20)
Các nguyên tử cacbon của 6 nhóm metyl cố độ dịch chuyển hóa học nh sau: δ=27,93 ppm (C23) δ=15,30 ppm (C24)
δ=14,65 ppm (C27) δ=19,32 ppm (C30)
Nguyên tử cacbon của nhóm –CHOH (C3) có độ dịch chuyển hóa học δ
=78,99 ppm.
Bảng 3.1. Bảng số liệu cộng hởng từ hạt nhân của chất TDH 23
Số C Nhóm C 13C – NMR (ppm) 1H- NMR (ppm) 1 CH2 37,48 1,19,m 2 CH2 27,25 3 CH-OH 78,94 4 C 38,82 5 CH 55,37 6 CH2 18,28 7 CH2 34,35 8 C 40,71 9 CH 50,57 10 C 37,20 11 CH2 20,89 12 CH2 25,54 2,21,td,J=12,5;3,0 13 CH 38,32 14 C 42,45 15 CH2 30,60 16 CH2 32,23 17 C 56,20 18 CH 49,27 1,61,m 19 CH 46,94 2,99,m
20 C 150,61 21 CH2 29,68 1,42,m 22 CH2 37,07 1,95,m 23 CH3 27,93 0,95,s 24 CH3 15,30 0,74,s 25 CH3 16,07 0,81,s 26 CH3 15,95 0,93,s 27 CH3 14,65 0,98,s 28 COOH 178,96 29 CH2 109,47 4,59,brs,H-29b 4,72,brs,H-29a 30 CH3 19,32
Sau khi biện luận phổ MS, 1H - NMR, 13C- NMR ta có chất A có cấu tạo nh sau:
Vậy chất A chính là axit betulinic
(67) Hợp chất TDH 23 (C30H48O3) H H HO OH 30 29 O 20 19 21 22 18 17 28 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 23 24 26 25 27
Hình 3.2. Phổ 1H- NMR của hợp chất A (TDH 23)
Hình 3.8. Phổ dãn DEPT của hợp chất A (THD 23) 3.2. xác định cấu tạo của hợp chất b (tdh 55)
Từ các số liệu phổ MS, 1H - NMR, 13C- NMR và so sánh với tài liệu công bố đã xác định đợc cấu trúc của chất B là axit pentacosanoic: CH3(CH2)23COOH
3.2.1. Phổ khối lợng MS (hình 3.9)
Phổ MS có pic ion phân tử [M++ 1]’ = 383 suy ra M’ = 382 tơng ứng với công thức phân tử C25H50O2
3.2.2. Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H- NMR (hình 3.10)
Phổ 1H- NMR của hợp chất B có những tín hiệu đặc trng sau: - Tín hiệu cộng hởng của 3 proton nhóm metyl vị trí 25 (3H25) có độ chuyển dịch hóa học δ = 0,88 ppm (triplet) do tơng tác spin – spin với 2 proton của 2 nhóm CH2 ở vị trí 24 (2H24) J = 6,5 Hz.
- Tín hiệu cộng hởng của 2 proton nhóm CH2 vị trí 2 (2H2) δ = 2,345 ppm (triplet) do tơng tác spin – spin với 2 proton nhóm CH2 (2H3), J = 7,5 Hz.
- Tín hiệu cộng hởng của 2 proton nhóm CH2 (2H3) δ = 1,63 ppm (multiplet) do có tơng tác spin – spin với 2 proton nhóm CH2 (2H2) và 2 proton nhóm CH2 (2H4).
- 42 proton của 21 nhóm CH2 từ vị trí 4 đến vị trí 24 có độ dịch chuyển hóa học δ = 1,254 ppm.
Bảng 3.2. Số liệu cộng hởng từ hạt nhân 1H-NMR của hợp chất TDH 55 ( Axit pentacosanoic) Số C Số H 1H-NMR (ppm) 25 3 0,88,t,J=6,5Hz 4 - 24 42 1,25,brs, 3 2 1,63,m 2 2 2,34,t,J=7,5Hz
Các số liệu phổ MS, 1H - NMR phù hợp với cấu tạo của axit pentacosanoic Pentacosanoic COOH 1 2 3 25
Hình 3.9.Phổ khối lợng của hợp chất B (TDH 55)
Kết luận
1. Từ cao cloroform của hoa sim bằng phơng pháp tách cột trên silicagel hệ dung môi rửa giải là n- hecxan: axeton tỷ lệ 19: 1; 9: 1; 4: 1; 2: 1; 100% axeton và axeton: metanol tỷ lệ 6: 4 và sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi n- hecxan: etylaxetat; cloroform: metanol: nớc với tỷ lệ thay đổi đã tách đợc hai chất A và B.
2. Cấu trúc của hai hợp chất A và B đợc xác định bằng phơng pháp phổ khối MS, phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR, 13C- NMR, DEPT. Kết quả cho biết hợp chất A là axit betulinic và hợp chất B là axit pentacosanoic.
COOH 1 2 3 25 H H HO OH 30 29 O 20 19 21 22 18 17 28 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 23 24 26 25 27 Chất A: axit betulinic Chất B: axit pentacosanoic
Tài liệu tham khảo Tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chơng, Nguyễn Thợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiến, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam- Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
2. Võ Văn Chi ( 1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, trang 1047– 1048, Nhà xuất bản y học, thành phố Hồ Chí Minh.
3. Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu, Tạ Thị Khôi và Piet A. Leclercq (1984), ”GC and GC/MS Analysis of the leaf oil of cleistocalyx operculatus (Roxb). Merr et Perry”, Journal of Essential Oil Reseach, 6, 661-662
4. Nguyễn Xuân Dũng, Trần Đình Thắng, Hoàng Văn Lựu (1999), Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu hoa sim- Tạp chí dợc liệu, 4 (4)tr. 108, 109.
5. Phan Minh Giang, Trần Thị Hà, Nguyễn Thị Hồng Anh, Phan Tống Sơn (2007), Nghiên cứu Hóa thực vật cây sim (Rhodomyrtus tomentosa Ait. Hassk, Myrtaceae), Hội nghị khoa học và công nghệ Hóa học Hữu cơ toàn quốc lần thứ t, Hà Nội tháng 10/2007, tr. 340-345.
6. Phạm Hoàng Lộ (2000), Cây cỏ Việt Nam- Nhà xuất bản trẻ.
7. Hoàng Văn Lựu (2003),Thành phần hóa học của tinh dầu rễ sim (Rhodomyrtus tomentosa Ait. Hassk) của Việt Nam- Tạp chí Hóa học và ứng dụng, 9, tr. 29-31.
8. Trần Đình Lý (Chủ biên) và các cộng sự (1994), 1900 loài cây có ích ở Việt Nam - Nhà xuất bản thế giới, Hà Nội.
9. Nguyễn Đức Minh (1975), Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.
11. Đỗ Thị Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học của hoa cây sim (Rhodomyrtus tomentosa Wight)- Luận văn tốt nghiệp Đại học- Trờng Đại học Vinh.
12. Trịnh Thị Thủy, Trần Văn Sung (1993-1994), ”Kết quả nghiên cứu hóa học của một số cây thuốc Việt Nam” Tuyển tập các báo cáo Khoa học- Viện hóa học, 213.
Tiếng Anh
13. A. Hou, Y.wu, Y. Liu Flavone glycosides and an ellagitannin from Downy Rosemyrte (Rhodomyrtus tomentosa) Zongcaoyao (9) 30(1999) 645-8
14. Asadhawut Hiranrat and wilawan Mahabasarham New acylphyloro glacinols from the leaves of Rhodomyrtus tomentosa. Tetrahedron, volume 64 issue 49, 1 Dec. 2008, 93- 97
15. Chick A. lgboechi, Robert T. parfitt and Michael G. Rowan
16. Cui B, Nakamura M, Kinjo J, Nohara T (1993), Chem. Pharm. Bull, 41, pp. 178-182.
17. Dachriyanus, S., Melvyn V. Sargent, Brian W.Skelton, IWang Soediro, Mumu Sutisna, Allan H. White and Elin Yulinah (2002), Rhodomyrtone, from Rhodomyrtus tomentosa an Antibiotic. Aust.j.chem. 55, pp. 229-232
18. E. Breitmaier and W. Voelter (1986), Carbon- 13 NMR Spectroscopy (VHC, Weiheim), p. 450 (Dimethylsulfoxide).
19. Hỹbner G, Wray V, Nahrstedt A(1999), Planta Med, 65, pp. 636-642 . 20. H. Ruqiang, D.Qui, L. Chunhong. Stady on purification and stability of the pigment from fructus rhodomyrti, Abs. Chem. Soc.20.29 March. 2007
21. H. Ruqiang, C.Sr. Yonglu. Stady on the oxidation resistance of fructus rhodomyrti, Abs. Chem. Soc.10.15 Sep. 2006
22. Joseph J Brophy, Robert J Goldsack Paul I. Forster. The Essential oils of the Australian species of Rhodomyrtus (Myrtacea) Published online 29. Apr. 1999
23. Jonh Wiley sons, Ltd 1997
24. L. He. Z. LiHua, T Jianbao, H. Qui, Y. Su Properties and extraction of pegment. From Rhodomyrtus tomentosa (Ait) Hassk. Jung xi Huagong Bianjibuu (6) 15 (1998) 27 – 9
25. Lowry. J. B (1996) , Phytochemistry , 15, pp. 513- 516.
26. Markham K.R, Chari V.M, Marby T.J. (1982), The flavonoids: Advances in Research Chapman and Hall, London
27. Nguyen Huu Tung, Yan Ding, Eun Mi Choi, Pham Van Kiem, Chau Van Minh and Young Ho Kim
New antharacene glycosides from Rhodomyrtus tomentosa stimulate ostcoblastic differentiation of MC 3T3- E1 cells Archives of pharmacal research volume 32, Nember 4, 515 – 520 (2009)
28. Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thanh and P.A. Leclercq (1996), Volatile constituents of Baeckia frutesceus L. (Myrtaceae) from Viet Nam. Jounal of Essential Oil Research.
29. ‘’Rhodomyrtus’’ Australian Plant Name Index (APWI), IBIS database. Centre for plant Biodiversity Research, Australian Government, Canberra. Ritrieved 2008 – 11- 02
30. Two dibenzofuran derivaties from fruit of Rhodomyrtus macrocarpa
phytochemistry, volume 23, Issne 5, 1984 pages: 1139- 1141
31. X. Wang. A chinese medicial composition with antiaging and yang invigorating effects, Faming Zhuanli Shenqing Gongkai Shouming CN 1203096 (1998).
32. Wai-HannHui and Man MoonLi (1975). Triterpenoids and steroids from Rhodomyrtus tomentosa- Phytochemistry, v. 14, pp. 833 - 834.
33. Wai-HannHui and Man MoonLi (1976). Two new triterpenoids from
Rhodomyrtus tomentosa- Phytochemistry, v. 15, pp. 1741- 1743. 34.Webby R.F(1991), Phytochemistry, 30, pp. 2443- 2444.
35. Y. Liu, A. Huo, C.Ji, Y. Wu. Isolation and structure of hydrolysable tannins of Rhodomyrtus tomentosa (Ait) Hassk Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa Bianjibu.
36. Y. Miyake, J. Nojima. Skin cosmetics and skin- beautiflying food containing Rhodomyrtus tomentosa extracts, Jpn. Kokai Tokyo Koho JP 2006199678 (2006) 9 tr.
37. Y. Miyake. The hair restor, the antiandrogen agent, testoserone alpha-reductase inhibitor and hair cosmetics, Jpn. Kokai Tokyo Koho JP 2006169133 (2006) 19 tr.
38. Y. Yao. Manufacture of a soft capsule treating gynecological disases, Faming Zhuanli Shenqing Gongkai Shuomingshu CN 1730011(2005) 8 tr.
39. Y. Yang. Medicial composition for treating migraine, Faming Zhuanli Shenqing Gongkai Shuomingshu CN 1824075 (2006) 13 tr.
40. Y. Wu. Chinese medicinal preparation for treating diseases of swine digestive track, Faming Zhuanli Shenqing Gongkai Shuomingshu CN 1201688 (1998).