3. Đối tợng nghiên cứu
2.1. Phơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Phơng pháp lấy mẫu
Mẫu tơi đợc lấy vào buổi sáng. Sau khi lấy về rửa sạch, chặt nhỏ sau đó ngâm qua etanol 960 rồi phơi bóng râm cho đến khô. Sau đó xử lý mẫu khô bằng cách ngâm với dung môi thích hợp thu đợc dịch chiết, cho bay hơi tự nhiên thu đợc các cao tơng ứng dùng cho nghiên cứu (sẽ nêu ở phần thực nghiệm).
2.1.2. Phơng pháp phân tích, tách và phân lập các chất
Để phân lập các hợp chất, chúng tôi tiến hành lần lợt các phơng pháp: *) Sắc ký cột thờng sử dụng silicagen cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm (254 - Merck). *) Sắc ký lớp mỏng (TLC).
*) Các phơng pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp giữa các phơng pháp phổ:
*) Phổ khối lợng EI - MS đợc ghi trên máy HP 5989 B - MS. Năng lợng bắn phá ở 70eV.
*) Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR đợc đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3.
*) Phổ 13C - NMR, DEPT, COSYGP, HSQC, HMBC đợc đo trên máy
BRUKER 125 MHz, dung môi CDCl3.
*) Phần mềm phổ mô phỏng ACD/HNMR BD.
(Các phổ trên đều đợc đo tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
2.2. Thực nghiệm2.2.1. Thiết bị và hóa chất 2.2.1. Thiết bị và hóa chất 2.2.1.1. Thiết bị *) Cột sắc ký thờng (chiều dài 1,4 m; đờng kính 4,5 cm). *) Cột sắc ký thờng (chiều dài 0.5 m; đờng kính 2 cm). *) Bộ chng cất thờng. *) Các thiết bị đo phổ *) Các vật dụng cần thiết khác 2.2.1.2. Hoá chất. *) Axit sunfuric. *) Axeton. *) Butanol. *) Clorofom.
*) Các dung môi đo phổ. *) Etylaxetat. *) Metanol. *) n-Hexan. *) Nớc cất. *) Iốt. *) Silicagel. 2.2.2. Tách và xác định cấu trúc các hợp chất 2.2.2.1. Tách các hợp chất
a) Thu hái mẫu
Rễ cây sắn thuyền đợc lấy vào tháng 10 năm 2009 ở huyện Triệu Sơn, tỉnh Thanh Hoá.
Mẫu sau khi lấy về đợc rửa sạch, chặt nhỏ sau đó đợc xử lí qua etanol 960 và phơi trong bóng râm cho đến khô.
b) Chiết và tách các hợp chất từ rễ cây sắn thuyền
Rễ cây sắn thuyền sau khi làm khô đợc ngâm trong metanol trong thời gian 45 ngày. Lọc dịch chiết và loại bỏ dung môi thu đợc cao metanol. Phần bả còn lại tiếp tục đợc ngâm với metanol trong thời gian 7 ngày rồi chiết nóng 3 lần thu thêm đợc một lợng cao nữa. Gom tất cả số cao này lại rồi phân tán vào trong nớc cất sau đó lần lợt chiết với các dung môi n-hexan, clorofom, etylaxetat, butanol. Cất thu hồi dung môi thu đợc các cao n-hexan, cao clorofom, cao etylaxetat, phần dịch chiết butanol và phần cặn. Cao etylaxetat đợc trộn đều với silicagel theo tỉ lệ 1 : 1 rồi lấy một phần cao cho vào cột sắc ký đã đợc nhồi bằng pha tĩnh là silicagel có cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (254 - Merck). Tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là etylaxetat - metanol với tỉ lệ tăng dần độ phân cực, lấy lần lợt các thể tích xác định chảy ra khỏi cột (80ml), cất thu hồi dung môi một phần rồi cho bay hơi tự nhiên thu đợc các phân đoạn tơng ứng đ- ợc trình bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Số liệu của quá trình chạy cột cao rễ sắn thuyền
TT Hệ dung môi EtOAc/CH3OH Tỉ lệ Phân đoạn
1 EtOAc/CH3OH 100 : 0 1 : 10 2 EtOAc/CH3OH 95 : 5 11 : 20 3 EtOAc/CH3OH 90 : 10 21 : 40 4 EtOAc/CH3OH 85 :15 41 : 50 5 EtOAc/CH3OH 80 :20 51 : 70 6 EtOAc/CH3OH 75 : 25 71 : 80 7 EtOAc/CH3OH 70 : 30 81 : 90 8 EtOAc/CH3OH 60 : 40 91 : 110 9 EtOAc/CH3OH 50 : 50 111 : 115 10 EtOAc/CH3OH 0 : 100 116 : 120
Sau khi cho dung môi vào rửa giải thấy trên cột xuất hiện năm khoảng màu. Dới cùng có màu trắng sữa, tiếp đến có màu vàng đậm, ở giữa có màu xanh đen, tiếp đến có màu vàng nhạt, trên cùng có màu đen.
Tại phân đoạn 50 tơng ứng với hệ dung môi 85:15 xuất hiện một lợng lớn chất rắn màu đỏ. Dùng hexan và axeton lạnh rửa nhiều lần sau đó đun nóng, lọc
nóng dung dịch để loại bỏ chất bẩn rồi để nguội thấy xuất hiện tinh thể. Quá trình đợc lặp lại nhiều lần thu đợc một hợp chất tơng đối sạch có màu đỏ dạng tinh thể hình khối. Triển khai sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi clorofom - metanol với tỉ lệ 8:2, hiện vết bằng hơi iôt cho một vệt màu đỏ có Rf=0,63/1=0,63 chúng tôi kí hiệu là chất A.
Tại phân đoạn 100 tơng ứng với hệ dung môi 60:40 có một lợng chất màu vàng nâu. Quy trình làm sạch và kết tinh đợc tiến hành giống hợp chất A chúng tôi thu đợc một hợp chất có dạng tinh thể màu vàng nâu kí hiệu là hợp chất B.
Ngâm trong metanol 45 ngày
Lọc dịch chiết và cất thu hồi dung môi
Mẫu khô
Chiết nóng 3 lần
Ngâm trong metanol 7 ngày
Phân tán vào nớc
Chiết với các dung môi và cất thu hồi dung môi n-hexan clorofom etylaxetat butanol
Nhồi cột
Rửa giải bằng dung môi etylaxetat - metanol
Hình 2.1. Sơ đồ tách các hợp chất từ rễ cây sắn thuyền
2.2.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất
Để xác định cấu trúc các hợp chất, chúng tôi sử dụng kết hợp các phơng pháp phổ:
*) Phổ khối lợng EI - MS đợc ghi trên máy HP 5989 B - MS. Năng lợng bắn phá ở 70 eV.
Bã mẫu Cao
metanol
Cao
n-hexan Cao clorofom Cao Dịch chiết butanol ETYLAXETAT Hệ dung môi 85:15 Hợp chất A Hệ dung môi 60:40 Hợp chất B
*) Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR đợc đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3.
*) Phổ 13C - NMR, DEPT đợc đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung
môi CDCl3.
(Các phổ trên đều đợc đo tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
Chơng 3
Kết quả và thảo luận
3.1. Xác định cấu trúc chất hợp chất A (TDR 9)
Cấu trúc của hợp chất A đợc xác định bằng phơng pháp phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR và 13C - NMR.
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR (hình 3.1; 3.2)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR của hợp chất A có những tín hiệu cộng hởng đặc trng nh sau:
Các proton thơm H2, H5 và H6 có độ chuyển dịch hóa học: H2: δ = 7,559 ppm (d), J = 2 Hz
H5: δ = 6,895 ppm (d), J = 8 Hz H6: δ = 7,639 ppm (d), J = 8 Hz
Hằng số tơng tác J = 8 Hz tơng ứng với hằng số tơng tác octo giữa proton H5 và H6.
Ba proton của nhóm metoxy (OCH3) có độ chuyển dịch hóa học δ = 3,902 ppm (singlet).
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR (hình 3.3; 3.4)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất A có các tín hiệu đặc trng sau:
Nguyên tử Cacbon của nhóm axit (- COOH) có độ chuyển dịch hóa học
δ=170,996 ppm. Các nguyên tử Cacbon của vòng thơm liên kết với nhóm OH
và OCH3 có độ chuyển dịch hóa học:
δ= 148,079 ppm (C4)
δ= 152,250 ppm (C3)
Nguyên tử Cacbon của nhóm metoxy (OCH3) có độ chuyển dịch hóa học
Chi tiết các số liệu phổ của hợp chất A đợc thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Số liệu cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR và 13C - NMR của hợp chất A. TT Nhóm 1H - NMR δ (ppm) 13C - NMR δ (ppm) 1 C - COOH 123.049 2 CH 7.559 (d), J = 2 Hz 115.566 3 C - OCH3 152.250 4 C - OH 148.079 5 CH - 6.895 (d), J = 8 Hz 113.721 6 CH - 7.639 (dd), J1 = 2 Hz; J2 = 8 Hz 124.890 OCH3 3.902 (s) 56.620 COOH 170.996
Từ số liệu phổ 1H - NMR và 13C - NMR, so sánh với phổ chuẩn đã xác định đợc cấu tạo của hợp chất A là axit vanilic. Công thức cấu tạo:
1 2 3 4 5 6 COOH OCH3 OH
3.2. Xác định cấu trúc hợp chất B (TDR 161)
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR (hình 3.6; 3.7)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR của hợp chất B có những tín hiệu cộng hởng đặc trng nh sau:
Tín hiệu cộng hởng của 5 proton thơm vòng C có độ chuyển dịch hóa học:
δ = 7,64 ppm (dd), J1 = 8 Hz; J2 = 2 Hz (H2 và H6)
δ = 7,40 ppm (triplet) (H3 và H5)
δ = 7,38 ppm (m) (H4)
Tín hiệu cộng hởng của hai proton etylenic HA và HB có độ chuyển dịch hóa học:
δ = 8,14 ppm (doublet), J = 15,5 Hz (HA)
δ = 7,86 ppm (doublet), J = 15,5 Hz (HB)
Hằng số tơng tác J = 15,5 Hz tơng ứng với hằng số tơng tác trans của proton HA và HB.
Proton thơm của vòng A là H3’ có độ chuyển dịch hóa học δ = 6,10 ppm. Tín hiệu cộng hởng của 6 proton của hai nhóm metoxy có độ chuyển dịch hóa học δ = 3,90 ppm và 3,86 ppm. Proton của nhóm OH ở vị trí 2’ có độ chuyển dịch hóa học δ = 13,88 ppm, của nhóm OH ở vị trí 6’ có δ = 6,93 ppm.
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR (hình 3.8; 3.9)
Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất B có các tín hiệu cộng hởng của 17 nguyên tử Cacbon. Trong đó có một số tín hiệu cộng hởng đặc trng sau:
Nguyên tử Cacbon của nhóm C = O có độ chuyển dịch hóa học δ =
192,44 ppm.
Hai nguyên tử Cacbon của nối đôi CA và CB có độ chuyển dịch hóa học:
δ = 126,72 ppm (CA)
δ = 143,41 ppm (CB)
Các nguyên tử Cacbon của vòng thơm A liên kết với các nhóm OH, OCH3 có độ chuyển dịch hóa học:
δ = 163,10 ppm (C6’)
δ = 158,36 ppm (C4’)
δ = 150,96 ppm (C2’)
Tín hiệu cộng hởng của hai nguyên tử Cacbon của hai nhóm OCH3: δ = 61,40 ppm và 55,98 ppm.
Chi tiết các số liệu phổ của hợp chất B đợc thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Số liệu cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR và 13C - NMR của hợp chất B. TT Nhóm 1H - NMR δ (ppm) 13C - NMR δ (ppm) 1 C 135,45 2 CH 7,64 (dd) J1 = 8Hz, J2 = 2Hz 128,86 3 CH 7,40 (t) 128,58 4 CH 7,38 130,24 5 CH 7,40 (t) 128,58 6 CH 7,64 (dd) J1 = 8Hz, J2 = 2Hz 128,86 A CH 8,14 (d) J = 15,5Hz 126,72 B CH 7,86 (d) J = 15,5Hz 143,41 1’ C 128,00 2’ C - OH 150,96 3’ CH 6,10 (s) 92,80 4’ C - OCH3 158,36 5’ C - OCH3 104,30 6’ C - OH 163,10 OCH3 3,86 (s) 61,40 OCH3 3,90 (s) 55,98 C = O 192,44
Từ các số liệu phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR và 13C - NMR của hợp chất B, so sánh với phổ chuẩn đã xác định đợc cấu trúc của hợp chất B là: 2’, 6’ - dihydroxy - 4’, 5’ - dimetoxy - chalcon. Công thức cấu tạo:
C OH O H H OH CH3O CH3O 1 2 3 4 5 6 1' 2' 3' 4' 5' 6' A B
Kết luận
Tiến hành nghiên cứu đề tài luận văn, chúng tôi đã thu đợc một số kết quả nh sau:
1. Từ rễ cây sắn thuyền, sử dụng phơng pháp chiết với dung môi metanol. Cao metanol đợc phân tán vào nớc, sau đó chiết lần lợt với các dung môi: n- hexan, clorofom, etylaxetat, n-butanol. Từ cao etylaxetat,sử dụng phơng pháp sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel, hệ dung môi rửa giải etylaxetat : metanol đã tách đợc hai hợp chất A và B.
2. Sử dụng các phơng pháp phổ cộng hởng từ hạt nhân, so sánh với phổ chuẩn đã xác định đợc cấu trúc của hợp chất A là axit vanilic và hợp chất B là 2’, 6’ - dihydroxy - 4’, 5’ - dimetoxy - chalcon.
Danh mục công trình
Nguyễn Văn Thanh, Hoàng Văn Lựu, Chu Đình Kính, Phan Thị Thu, Nguyễn Thúc Thu (2010), “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây sắn thuyền Syzygium resinosum (Gagnep) Merr. Et Perry”, Tạp chí Dợc học.
Tài liệu tham khảo
1. Đỗ Huy Bích và những ngời khác (2004), Cây thuốc và động vật làm
thuốc ở Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Xuân Dũng, Đào Hữu Vinh và các cộng sự (1985), Các phơng
pháp sắc ký, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
3. Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu, Tạ Thị Khôi and Piet A. Leclercq
(1984), GC and GC/MS Analysis of the leaf oil of Cleistocalyx
operculatus (Roxb). Merr et Perry, Journal of Essential Oil Reseach, 6,
661-662.
4. Nguyễn Xuân Dũng, Trần Đình Thắng, Hoàng Văn Lựu, “Nghiên cứu
thành phần hóa học của tinh dầu hoa sim”, Tạp chí Dợc liệu, số 4, tập 4, tr.108 - 109.
5. Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu (1997), “Nghiên
cứu thành phần hóa học cây vối ở Nghệ An”, Tạp chí Hóa học, tập 35, số 3, tr.47 - 51.
6. Nguyễn Văn Đậu, Nguyễn Thị Thuận, Đỗ Thị Thanh (2007), “Phân lập
một số hợp chất từ lá cây vối”, Tuyển tập công trìnhHhội nghị khoa học và
công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, tr.311 - 315.
7. Phan Minh Giang, Trần Thị Hà, Nguyễn Hồng Anh, Phan Tống Sơn
(2007), “Nghiên cứu hóa thực vật cây sim (rhodomyrtus tomentosa (Ait) Hassk. Myrtaceae”, Tuyển tập công trình Hội nghị khoa học và công
nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, tr.340 - 345.
8. Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Ngô Văn Quang, Phan Văn Kiên
(2007), “Axit asiatic phân lập từ cây sắn thuyền (Syzygium resinosum) và có tác dụng lên vi khuẩn Streptoccus mutans”, Tạp chí Dợc học số 7.
9. Văn Ngọc Hớng, Nguyễn Xuân Sinh (2003), “Isolasion and Identification of two triterpenoids from the leaves of Syzygium
resinosum Gagnep”. 8th Eurasia conference on chemical sciences, Ha Noi,
october 21 - 24, p.p.355
10. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học.
11. Hoàng Văn Lựu (1996), Nghiên cứu thành phần hóa học một số cây
thuộc họ Sim (Myrtaceae) ở Nghệ An, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Hóa
học - Trờng Đại học S phạm Hà Nội.
12. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thị Anh Đào (1994), “Đặc trng
hóa học tinh dầu hoa vối (cleistocalyx operculatus Roxb. Merr et Perry) của Việt Nam”, Thông báo khoa học, Đại học S phạm Hà Nội I, (4), 32 - 34.
13. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Quang Tuệ (2004), “Thành phần hóa học của
cây gioi”, Tạp chí Phân tích hóa, lý và sinh học, Tập 9, số 1, tr.20 - 23.
14. Nguyễn Đức Minh (1975), Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam,
Nxb Y học.
15. Nguyễn Duy Nh (2008), “Trị tiêu chảy bằng ổ”, Tạp chí Khoa học phổ
thông, số 87, tr.14 - 16
16. Nguyễn Văn Thanh (2008), Tách và xác định cấu trúc của một số hợp
chất từ cây vối cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr. Et Perry ở Nghệ
An và cây sắn thuyền syzygium resinosum (gagnep) Merr. Et Perry ở
Thanh Hóa, Luận văn Thạc sĩ Hoá học - Trờng Đại học Vinh.
17. Trịnh Thị Thuỷ, Trần Văn Sung (1993 - 1994), “Kết quả nghiên cứu hóa
học một số cây thuốc Việt Nam”, Tuyển tập các báo cáo Khoa học -
Viện Hóa học, 213.
19. C. l. Ye, J. W. Liu, D. Z. Wei, Y. H. Lu, F. Quian (2005), Cancer
chemother Pharmacol, 55(5), 447 - 452.
20. Corie Djadjo, Michel Delmee, Joelle Quetin - Leclercq, Antimicrobial activity of bark extract of Syzygium jambor (L) Alston (Myrtaceae),
Journal of Ethnopharmacology 71, 108 - 109
21. Dachriyanus. Salni, Meloyn V. Sargent, Brian W. Skelton, Iwang Soediro, Mumu Sutisna, Allan H. White and Elin Yulinal (2002), Rhodomyrtone, an antibiotic from Rhodomyrtus tomentosa, Austr. J. Chem, 55, 229 - 232
22. Karla Slowing, Monica Sollhuber, Emilia Carretero and Angel Villor (1994), Flavonoid glycosid from Eugenia jambor, Phytochemistry, Vol.