Húa chất và thiết bị - Đối tượng nghiờn cứu- 123docz.net

3. Đối tượng nghiờn cứu

3.1. Húa chất và thiết bị

3.1.1. Húa chất

Cỏc dung mụi để ngõm chiết mẫu thực vật đều dựng loại tinh khiết (pure), khi dựng cho cỏc loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phõn tớch (PA).

Dung mụi ngõm chiết:  Metanol (CH3OH)  n – Hexan (n-C6H14)  Clorofom (CHCl3)

 Etylaxetat (CH3COOC2H5)

Dung mụi dựng sắc ký cột: Hệ dung mụi: clorofom – metanol.

3.1.2. Dụng cụ và thiết bị

 Mỏy cụ quay chõn khụng, cột sắc ký, bỡnh cầu, ống nghiệm…  Cỏc phương phỏp sắc ký:

Sắc ký cột: Sử dụng silicagen 254 (Merck), cỡ hạt silicagen chạy cột là 0,04 – 0.06 mesh.

Sắc ký bản mỏng: Sắc ký bản mỏng phõn tớch được tiến hành trờn bản mỏng kớnh silicagen Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm.

Hiện màu: hơi iot và đốn UV 254nm

Tinh chế cỏc hợp chất bằng kết tinh phõn đoạn, rửa trong cỏc dung mụi khỏc nhau.

 Cỏc phương phỏp phổ:

Phổ khối lượng EI – MS (positive, negative) được ghi trờn mỏy HP 5989B – MS.

Viện Húa học – Viện Khoa học Tự nhiờn và Cụng nghệ Quốc gia. Năng lượng bắn phỏ ở 70eV.

Phổ 1H –NMR được đo trờn mỏy BRUKER 500 MHz, dung mụi CDCl3.

Phổ 13C – NMR, DEPT, COSYGP, HSQC, HMBC được đo trờn mỏy BRUKER 125 MHz dung mụi CDCl3.(Viện Húa học – Viện Khoa học Tự nhiờn và Cụng nghệ Quốc gia).

3.2. Nghiờn cứu tỏch hợp chất từ thõn cõy bự tru

Mẫu thõn cõy bự tru được lấy ở Hà Tĩnh vào ngày 24 thỏng 11 năm 2008, được định danh bởi TS Nguyễn Quốc Bỡnh – Viện Sinh học Khoa học Quốc gia.

Thõn được rửa sạch, phơi khụ nhẹ trong búng rõm, tỏn nhỏ, ngõm với metanol khoảng 30 ngày. Cất thu hồi dung mụi được cao metanol.

Chiết lần lượt cao metanol với dung mụi cú độ phõn cực tăng dần n- hexan, clorofom, etylaxetat, metanol thu hồi cỏc cao tương ứng.

 Cao n – hexan được phõn tớch bằng sắc ký cột:

+) Hệ dung mụi rửa giải: clorofom: metanol = 65: 35 thu được 8 phõn đoạn.

Cao n - hexan Cao etylaxetat Cao clorofom Cao metanol Dịch nước Mẫu bù tru khô

Cao tổng 254g 60g 200g 310g 900g 8kg

Ngâm chiết trong các dung môi khác Cô, thu hồi dung môi

Ngâm chiết trong metanol

Cô, thu hồi dung môi

Sắc ký cột 3 3 CH Cl - CH OH 85 :15 Hợp chất B Hợp chất A

Sơ đồ 1: Quỏ trỡnh ngõm, chiết, tỏch hợp chất từ thõn cõy bự tru

(Uvaria grandiflora).

Mẫu thõn (15 kg) được cắt nhỏ, phơi khụ sau đú đem nghiền nhỏ (8 kg), nhõm với metanol ở nhiệt độ phũng. Cất thu hồi dung mụi được cao tổng (900 g).Phõn bố trong nước, chiết lần lượt với n- hexan, etyl axetat, clorofom, metanol cất thu hồi dung mụi được cỏc cao tương ứng là: 310g, 200g, 60g, 254g.

Cao etyl axetat được phõn tỏch trờn cột silicagen, với hệ dung mụi rửa giải: clorofom: metanol. Thu được 8 phõn đoạn. Phõn đoạn 135 - 143 thu chất rắn màu trắng. Tinh chế và kết tinh lại nhiều lần bằng clorofom và metanol thu được cỏc hợp chṍt A và B.

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Xỏc định cấu trỳc hợp chất A 4.1.1.Phụ̉ khụ́i lượng (ESI-MS)

Phụ̉ khụ́i lượng phun mù electron(ESI-MS) negtive [M+H]+ cho pic 297:

Hỡnh 1:Phụ̉ khụ́i lượng phun mù electron(ESI-MS) negtive của A

Từ hai phụ̉ trờn, ta có phõn tử lượng của B là 296, ứng với cụng thức phõn tử C17H12O5

4.1.2. Phụ̉ cụ̣ng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H -NMR của hợp chất A cho 3 tớn hiệu singlet, trong đú 1 tớn hiệu singlet ở δ = 2.13ppm tương ứng với 3 hiđro (H-9) của nhúm CH3, 2 tớn hiệu singlet tại δ =6.83ppm (H-3), δ = 10.50ppm (-CHO).

Tớn hiệu doublet ở δ = 7.89ppm tương ứng gỏn cho 2 hiđro H-2’ và H-6’ ở cỏc vị trớ C-2’ và C-6’.

Tớn hiệu triplet tại δ = 7.59ppm tương ứng, gỏn cho 3 hidro ở cỏc vị trớ C-3’; C-4’; C-5’.

Như vậy phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR của A tỡm thấy 10 nguyờn tử hiđro.

Từ đú ta cú bảng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR của A như bảng 3 No C δH(ppm) 1 O 2 C 3 CH 6.83 4 C 4a C 5 C 6 C 6a CHO 10.50 7 C 8 C 8a C 9 CH3 2.13 1’ C 2’ CH 7.89 3’ CH 7.59 4’ CH 7.59 5’ CH 7.59 6’ CH 7.89

Bảng 3:Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR của A 4.1.3. Phụ̉ cụ̣ng hưởng từ hạt nhõn 13C-NMR

Từ đú ta cú bảng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C-NMR của A như bảng 4: No C δC(ppm) 1 O 2 C 164.1 3 CH 107.1 4 C 181.9 4a C 104.4 5 C 158.2 6 C 102.9 6a CHO 189.8 7 C 167.2 8 C 108.8 8a C 165.4 9 CH3 6.4 1’ C 130.7 2’ CH 126.4 3’ CH 129.6 4’ CH 132.7 5’ CH 129.6 6’ CH 126.4

Bảng 4: Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C-NMR của A

4.1.4. Phổ DEPT

Phổ DEPT của hợp chất A cú cỏc giỏ trị cụ thể như sau:

- Phổ DEPT 90 cho thõý A cú 6 nhúm CH, trong đú tớn hiệu singlet tại

δ =107.1ppm (C-3) và δ =132.7ppm (C-4’); tớn hiệu douplet tại δ = 126.4ppm (C-2’,C-6’) và δ =129.6ppm (C-3’, C-5’). Ngoài ra tớn hiệu singlet tại

δ = 189.8ppm cho biết sự cú mặt của nhúm CHO.

- Từ phổ DEPT 135 (phần trờn) kết hợp với DEPT 90 ta thấy, ngoài cỏc tớn hiệu của nhúm CH thỡ DEPT 135 cũn cho thấy sự cú mặt của một nhúm CH3 tại δ =6.4ppm (C-9).

- Phổ DEPT 135 (phần dưới) khụng xuất hiện vạch nào, chứng tỏ trong phõn tử khụng cú nhúm CH2.

Dựa vào phổ DEPT và kết hợp với DEPT 90, DEPT 135 ta thấy A cú 9 C khụng liờn kết với H tại δ= 181.9ppm (C-4); δ =167.2ppm (C-7); δ =165.4ppm (C- 8a); δ=164.1ppm (C-2); δ= 158.2ppm (C-5); δ=130.7ppm (C-1’); δ =108.8ppm (C-8); δ =104.4ppm (C-4a); δ =102.9ppm (C-6). Vậy A cú cụng thức phõn tử là C17H12O5

4.1.5 Phổ COSYGP

Cho biết tương tỏc giữa H-H: Cú 4 tương tỏc đối xứng nhau: H2’-H3’; H3’-H2’ và H5’-H6’; H6’-H5’:

Hỡnh 10. Phổ COSYGP của hợp chất A (phổ gión) 4.1.6 Phổ HMBC

Phổ HMBC cho thấy sự tương tỏc xa giữa C-H. Cụ thể như sau: C2-H2’; C2-H6’; C2-H3; C4a-H3; C6-H6a; C7-H6a; C7-H9; C8a-H9; C2’-H6’, C2’-H4’; C3’-H5’; C4’-H2’; C4’-H6’;C5’-H3’; C6’-H2’; C6’-H4’. Cụ thể như sau:

Hỡnh 12. Phổ HMBC của hợp chất A (phổ gión) 4.1.7. Phổ HSQC

Phổ HSQC thể hiện sự tương tỏc gần giữa C-H, cụ thể như sau: C3-H3; C8-H8; C6a-H6a; C9-H9, C2’-H2’; C3’-H3’; C4’- H4’; C5’-H5’; C6’-H6’.

Kết hợp cỏc số liệu phổ khối, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSYGP so sỏnh với tài liệu [17,8,3], cho thấy cấu trỳc của chất A là Unonal tờn IUPAC là 6-Formyl-5,7-dihydroxy-8-methylflavone. Cú cụng thức cấu tạo là: O O OH HO CH3 1 2 3 4 5 6 7 8 8a 1' 2' 3' 4' 5' 6' H O 4a 6a 9 Unonal (6-Formyl-5,7-dihydroxy-8-methylflavone) 4.2. Xỏc định cấu trỳc hợp chất B

Hợp chất B là chất rắn tinh thể màu trắng. Kết tinh dưới dạng tinh thể hỡnh kim trong n-hexan/axeton. Tan tốt trong dung mụi metanol (CH3OH) và benzen (C6H6).

4.2.1. Phụ̉ khụ́i lượng (ESI-MS)

Hỡnh 15: Phổ khối lượng phun mự electron (ESI-MS) negative

Ngoài ra, phụ̉ khụ́i lượng phun mù electron (ESI-MS) positive cho pic [M-H]+ 191:

Hỡnh 16: Phổ khối lượng phun mự electron (ESI-MS) positive

Từ hai phụ̉ trờn, ta có phõn tử lượng của B là 192, ứng với cụng thức phõn tử C10H8O4

4.2.2. Phụ̉ cụ̣ng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H -NMR của hợp chất B cho 3 tớn hiệu singlet, trong đú 1 tớn hiệu singlet ở δ = 3,808 ppm tương ứng với 3 hiđro

(H-11) của nhúm –OCH3. Cỏc tớn hiệu singlet trong vựng thơm ở δ = 7,16 ppm và δ = 6,75 ppm tương ứng với 2 hiđro (H-5, H-8) của nhõn thơm ở cỏc vị trớ C-5 và C-8.

Cỏc tớn hiệu doublet ở δ = 7,85 ppm (J=9,5 Hz) và δ = 6,18 ppm (J=9,5 Hz) tương ứng gỏn cho 2 hiđro H-4 và H-3 ở cỏc vị trớ C-4 và C-3.

Tớn hiệu pic ứng với H-12 được gỏn cho hiđro của nhúm –OH ở vị trớ C-7.

Như vậy phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR của B tỡm thấy 8 nguyờn tử hiđro.

4.2.3. Phụ̉ cụ̣ng hưởng từ hạt nhõn 13C-NMR

Phổ cộng hởng từ hạt nhận 13C-NMR cho thấy tín hiệu 10 cacbon:

Hỡnh 19. Phổ 13C-NMR của hợp chất B O O HO H3CO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 10

Hỡnh 20. Phổ 13C-NMR của hợp chất B (phổ dón) O O HO H3CO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 10

Cacbon Độ dịch chuyển hoá học (ppm) C- 2 160,6 C- 3 111,6 C- 4 144,3 C- 5 109,6 C- 6 145,2 C- 7 151,1 C- 8 102,7 C- 9 149,4 C- 10 110,5 C - 11 55,9 Bảng 5: Số liệu phổ 13C- NMR của hợp chất B 4.2.4. Phổ DEPT

Phổ DEPT của hợp chất B cú cỏc giỏ trị cụ thể như sau:

- Phổ DEPT 90 cho 4 vạch chứng tỏ cú 4 nhúm CH ở δ (ppm): 102,7 (C- 8); 109,6 (C- 5); 111,6 (C- 3); 144,3 (C- 4).

- Từ phổ DEPT 135 (phần trờn) cú 5 vạch, cho biết tổng số nhúm CH và CH3 là 5 nhúm. Kết hợp với phổ DEP 90, suy ra số nhúm CH3 trong phõn tử là 1 nhúm, ở δ = 55,9 ppm (C - 11).

- Phổ DEPT 135 (phần dưới) khụng xuất hiện vạch nào, chứng tỏ trong phõn tử khụng cú nhúm CH2.

Số nguyờn tử C khụng liờn kết với hyđro bằng 5, tương ứng với cỏc vạch ở δ (ppm): 110,5 (C- 10); 145,2 (C- 6); 149,4 (C- 9); 151,1 (C- 7); 160,6 (C- 2). Trong đú cú 3 C của vũng bezen liờn kết với O ở dạng C-O, ứng với cỏc pic δ (ppm): 145,2 (C- 6); 149,4 (C- 9); 151,1 (C- 7) và 1 C liờn kết dạng C=O ứng với δ = 160,6 (ppm).

Hỡnh 21. Phổ DEPT của hợp chất B

Từ đú ta cú số liệu được trỡnh bày ở bảng sau:

O O HO H3CO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 10

Vị trớ C Nhúm δ C (ppm) Thớ nghiệm (DEPT) δ C (ppm) tài liệu [17, 8] δ H (ppm) Thớ nghiệm 2 C=O 160,6 161,5 3 CH 111,6 112,5 6,18 (J=9,5 Hz) 4 CH 144,3 144,0 7,85 (J=9,5 Hz) 5 CH 109,6 109,7 7,16 6 C 145,2 146,3 7 C 151,1 153,1 8 CH 102,7 104,2 6,76 9 C 149,4 149,7 10 C 110,5 111,1 11 OCH3 55,9 56,3 3,80 Bảng 6. Số liệu phổ NMR của hợp chất B Vậy hợp chất B cú cụng thức phõn tử là: C10H8O4. 4.2.5. Phổ HMBC

Phổ HMBC cho thấy sự tương tỏc xa giữa C-H. Cụ thể như sau: C8-H4, C8-H5, C5-H4, C10-H8, C10-H3, C4-H5, C6-H8, C6-H11, C9-H4, C9-H5, C2-H4, C7-H5, C2-H3.

Hỡnh 23. Phổ HMBC của hợp chất A (phổ gión)

Phổ HSQC thể hiện sự tương tỏc gần giữa C-H, cụ thể như sau: C11- H11, C8-H8, C5-H5, C3-H3, C4-H4.

4.2.7. Phổ COSYGP

Phổ COSYGP cho biết tương tỏc giữa H-H: Cú 2 tương tỏc đối xứng nhau: H4-H3, H3-H4.

Hỡnh 26. Phổ COSYGP của hợp chất B

Kết hợp cỏc số liệu phổ khối, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSYGP so sỏnh với tài liệu [17,8,3], cho thấy cấu trỳc của chất B là scopoletin, tờn IUPAC là 7-Hydroxy-6-methoxycoumarin. Cú cụng thức cấu tạo là:

O O HO H3CO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Scopoletin

Scopoletin là tinh thể hỡnh kim màu trắng (trong metanol), điểm núng chảy 203 – 204oC; TLC: Rf = 0,54 (CH2Cl2/MeOH 95:5); UV (EtOH) λmax (logε) = 227; 255; 259; 298; 345 nm; IR (KBr) νmax: 3285 (OH); 1703 (C=O);

1561 (aromat); 1506; 1291; 1143; 858 cm-1[3].

Đõy là hợp chất thuộc nhúm chất coumarin cú giỏ trị chữa bệnh, cú tỏc dụng tăng cường sự chuyển hoỏ. Lần đầu tiờn nú được phõn lập từ cõy bự tru (uvaria grandiflora), nú cũng tỡm thấy trong nhiều loại cõy như Morinda Citrifolia (trỏi nhàu), Morinda longisima (nhú đụng) [6], Kydia glabrescens

[3], conyza Linifolia [10], Launaea Refedifolia [12], Ipomoea cairia [23],

Salsola baryosma [21].

Năm 2007, nhúm cỏc nhà khoa học Nhật Bản đó tiến hành tổng hợp scopoletin và scopolin đi từ p- coumarin acid [12].

Năm 2007, cỏc tỏc giả Nguyễn Vũ Phong (Đại học Nụng Lõm TP. Hồ Chớ Minh) cựng Alain Hehn, Frộdộric Bourgaud (Phỏp) đó tổng hợp cỏc hợp chất cumarin (trong đú cú scopoletin) theo con đường sinh tổng hợp xuất phỏt từ sự biến đổi axit cinnamic.

Kấ́T LUẬN

Nghiờn cứu thành phần hoỏ học cành cõy bự tru (uvaria grandiflora)

chỳng tụi đó thu được một số kết quả như sau:

- Bằng cỏc phương phỏp ngõm chiết với cỏc dung mụi chọn lọc rồi cất thu hồi dung mụi thu được cỏc cao tương ứng.

- Từ cao etylaxetat bằng việc sử dụng cỏc phương phỏp sắc ký cột và kết tinh phõn đoạn thu được hai hợp chất là A và B.

- Sử dụng cỏc phương phỏp phổ hiện đại: phổ khối lượng phun mự electron (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSYGP xỏc định được hợp chất A là unonal, tờn IUPAC là 6-formyl-5,7-dihydroxy-8-methylflavon. Hợp chất B là scopoletin, tờn IUPAC là 7-hydroxy-6-methoxycoumarin. Cú cụng thức cấu tạo như sau:

O O OH HO CH3 1 2 3 4 5 6 7 8 8a 1' 2' 3' 4' 5' 6' H O 4a 6a 9 HO O O H3CO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Unonal Scopoletin

Công trình liên quan đến luận văn

Trần Đăng Thạch, Nguyễn Văn Hựng - Viện Hoỏ học - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam, Lờ Văn Hạc, Hồ Quốc Việt, Tống Thị Mai Nhung, Nguyễn Mạnh Tuấn - Khoa Hoỏ - Trường Đại học Vinh, Tỏch và xỏc định cấu trỳc một số hợp chất từ cõy Bự Tru (Uvaria grandiflora Roxb. & Hornem) ở Hà Tĩnh.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Tiến Bõn (chủ biờn) (2003), Danh mục cỏc loài thực vật Việt Nam, Nxb Nụng nghiệp, Hà Nội.

2. Nguyễn Tiến Bõn (2000), Họ Na (Annonaceae), Thực vật chớ Việt Nam, Flora of Vietnam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Vũ Văn Chuyờn, Lờ Trần Chấn, Trần Hợp (1987), Địa lý cỏc họ cõy Việt Nam, Nxb Khoa học Kỷ thuật, Hà Nội.

4. Nguyễn Thượng Dong và những người khỏc (2006), Nghiờn cứu thuốc từ thảo dược, Nxb Khoa học và Kỷ thuật, Hà Nội.

5. Trần Đỡnh Đại (1998), Khỏi quỏt về hệ thực vật Việt Nam, Hội thảo Việt - Đức về Húa học và cỏc hợp chất thiờn nhiờn, Hà Nội, 16 - 18 April, tr.17 - 27.

6. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương phỏp nghiờn cứu húa học cõy thuốc, Nxb Y học, Hà Nội.

7. Phạm Hoàng Hộ (1992), Cõy cỏ Việt Nam, Montreal.

Tiếng anh

8. Akendengue. B et al. (2003), Acaricidal activity of Uvaria versicolor and Uvaria Klaineana (Annonaceae) Phytother Res 17: 364 - 7.

9. Asha, K N et al. (2003), Antibacterial activity and cytotoxicity of extractives from Uvaria hamiltonii stem bark Fitoterapia 74: 159 - 63.

10. Asha, Kamrun Nahar et al. (2004), Steroids and polyketides from Uvaria hamiltonii stem bark Acta Pharm 54: 57 - 63.

11. Fall, Djibril et al. (2002), Cis-bullatencin, a linear acetogenin from roots of Uvaria chamae Nat Prod Lett 16: 315 - 21.

12. Ichimaru, Momoyo et al. (2004) Cytotoxic C-benzylated dihydrochalcones from Uvaria acuminata Chem Pharm Bull (Tokyo) 52: 138 - 41.

13. Nkunya, Mayunga H. H et al. (2004) (+/-)-Schefflone: a trimeric monoterpenoid from the root bark of Uvaria scheffleri Phytochemistry 65: 399 - 404.

14. Liu. A et al. (2005), A new cerebroside from Uvaria tonkinensis var. subglabra J. Asian Nat Prod Res 7: 861 - 5.

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU...1

1. Lý do chọn đề tài...1

2. Nhiệm vụ nghiờn cứu...2

3. Đối tượng nghiờn cứu...2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ HỌ NA (ANNONACEAE)...3

1.1. Họ Na (Annonaceae)...3

1.2. Chi Uvaria[3]...5

1.2.1. Những loài thuộc chi Uvaria...5

1.2.2. Thành phần húa học...7