quả vú dê, châu pèng mọc, cách thư đa hùng.
1.3.1. Đặc điểm thực vật
Cây Dời dơi có tên khoa học là Fissistigma polyanthoides (DC.) Merr, được phân bố như ở Lào Cai (Sapa, Phố Lu, Bắc Hà), Sơn La (Sông Mã, Sốp Cộp), Cao Bằng (Quảng Hoà), Lạng Sơn(Hữu Lũng), Bắc Cạn (Chợ Đồn), Thái Nguyên (Lạng Hít), Quảng Ninh (Tiên Yên, Hà Cối), Phú Thọ (Cầu Hai, La Phù), Hà Tây (Ba Vì, Đá Chông), Hoà Bình, Ninh Bình (Chợ Ghềnh), Đắc Lắc (Đắc Mil), Lâm Đồng, Nghệ An (Quỳ Châu). Còn có ở Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Tây).
Đặc điểm thực vật : Tiểu mộc trườn, nhánh có lông mịn, lá có phiến bầu dục tròn dài, tà 2 đầu, mặt dưới có lông hoe dày, cuống 12 mm. Chụm đối diện với lá, cánh hoa có lông ở mặt ngoài, cánh hoa ở trong nhỏ, tâm bì 4 noãn. Trái tròn, có lông như tơ, to 2-3 cm. Ra hoa tháng 2-4, có quả tháng 4-6.
Ảnh: Lá và hoa cây Fissistigma polyanthoides.
1.3.2.Thành phần hóa học
Năm 1999 Vichien Jongbunprasert, Rapepol Bavovada và các cộng sự từ vỏ cây
Fissistigma polyanthoides được hái từ vườn quốc gia Namnao, Petchaboon Thái Lan đã phân lập được 3 flavonoit có tên là: 5,8-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavone (1); 2’,5’-dihydroxy-3’,4’,6’-trimethoxy dihydro-chalcone (2);
(-)-6-hydroxy-5,7,8-trimethoxy flavanoene (3 ) và một ankaloit (4) có tên (-)-thaipetaline [18]. O O OH H3CO H3CO OH (1) O OH OCH3 H3CO OCH3 HO (2)
OCH3 H3CO HO OCH3 O 7 8 9 4 3 21' 2'3' 4' 5' 6' 6 5 10 O (3) N OH H3CO H3CO OCH3 OH 1 234 5 6 7 8 9 10 11 12 13 4a 14 8a 12a (4) 1.3.3. Dược lý
Hoa và rễ của cây dời dơi ( fissistigma polyanthoides) được dùng làm thuốc bổ, có khi còn dùng chữa ỉa chảy[1,2].
Quả ngọt có vị thơm ăn được. Ðồng bào dân tộc Dao dùng thân dây sắc nước làm thuốc uống bổ, có khi còn dùng chữa ỉa chảy.
Ở Trung Quốc, rễ dùng trị phong thấp, đòn ngã, mụn ghẻ, lá trị háo suyễn, mụn ghẻ.
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Phương pháp lấy và xử lý mẫu
Mẫu được thu hồi vào tháng 2 năm 2011 tại Quỳ Châu (Nghệ An), gồm phần lá. Mẫu thực vật được định danh bởi ThS Nguyễn Quốc Bình – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam định danh.
Mẫu tươi sau khi thu về được cắt nhỏ, phơi khô tự nhiên ở nơi thoáng mát. Khi mẫu đã khô, tiến hành xay nhỏ và ngâm mẫu với dung môi metanol tinh khiết. Làm bay hơi dung môi rồi xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các chất dùng cho nghiên cứu được trình bày ở phần thực ngiệm.
Các phương pháp được sử dụng để phân tích, phân lập trong quá trình nghiên cứu gồm:
- Sắc ký cột (CC).
- Sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc các hợp chất được xác định nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phương pháp khối phổ
- Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H - NMR. - Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13C – NMR. - Phương pháp DEPT.
- Phổ hai chiều COSYGP. - Phổ hai chiều HSQC. - Phổ HMBC
2.2. Thực nghiệm
2.2.1. Hóa chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA).
Dung môi ngâm chiết: - Metanol (CH3OH)
- Metylen clorua (CH2Cl2) - Clorofom (CHCl3) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Etylaxetat (CH3COOC2H5)
Dung môi dùng sắc ký cột: Hệ dung môi: clorofom – metanol.
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
- Máy cô quay chân không, cột sắc ký, bình cầu, ống nghiệm… - Các phương pháp sắc ký:
Sắc ký cột: Sử dụng silicagen 254 (Merck), cỡ hạt silicagen chạy cột là 0,04 – 0.06 mesh.
Sắc ký bản mỏng: Sắc ký bản mỏng phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagen Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm.
Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254nm
Tinh chế các hợp chất bằng kết tinh phân đoạn, rửa trong các dung môi khác nhau. - Các phương pháp phổ:
Phổ khối lượng EI – MS (positive, negative) được ghi trên máy HP 5989B – MS. Viện Hóa học – Viện Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. Năng lượng bắn phá ở 70eV.
Phổ 1H –NMR được đo trên máy BRUKER 500 MHz, dung môi CDCl3.
Phổ 13C – NMR, DEPT, COSYGP, HSQC, HMBC được đo trên máy BRUKER 125 MHz dung môi CDCl3 (Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
2.3. Nghiên cứu tách hợp chất từ lá cây dời dơi (Fissistigma polyanthoides)
Mẫu lá cây dời dơi ( Fissistigma polyanthoides) được thu hái, rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, nghiền nhỏ thành bột (8 kg), ngâm trong 40 lít EtOAc+4% dung dịch NH3, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được 980 g cao tổng. Phân bố cao tổng trong 2,5 lít dung dịch HCl 2N, rồi chiết 3 lần với EtOAc, cất loại dung môi thu được 280 g cặn chứa ancaloit (X). Dịch nước còn lại được kiềm hoá bằng dung dịch Na2CO3 10% đến pH=8 rồi chiết 3 lần với dung môi CH2Cl2, cất loại dung môi được 153 g cặn CH2Cl2 chứa ancaloit (Y).
Tiến hành sắc kí cao clorofom (125 g) trên cột silicagel (63-200 μm, 3x50 cm) với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH có 4% dung dịch NH3, gradient (0-100%) được 35 phân đoạn (F1-F35). Từ phân đoạn F8 (13 g) chạy cột sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH (1/9) loại bỏ chất màu thu được 16 phân đoạn (F8.1-F8.16). Từ phân đoạn F8.7 (235 mg) chạy cột silicagel (40-63 μm, 2x50 cm) với hệ dung môi CH2Cl2- MeOH gradient (0-100%) thu được 19 phân đoạn (F8.7.1-F8.7.19). Từ phân đoạn F8.7.6
(32 mg) dùng bản mỏng điều chế với hệ dung môi benzen-MeOH (9/1) có 4% dung dịch NH3 thu được chất A (15 mg). Từ phân đoạn F8.12 (150 mg) chạy cột silicagel (40-63 μm, 2x50 cm) với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH gradient (0-70%) thu được chất B (17 mg).
Sơ đồ tách các hợp chất A và B
L¸ kh«(8kg)
- Ng©m trong etyl axetat - Chng cÊt lo¹i etyl axetat Cao tæng (980 g)
-Ng©m trong HCl 2N -ChiÕt 3 lÇn víi etyl axetat
CÆn X (280 g)
- kiÒm hãa b»ng Na2CO3 -ChiÕt 3 lÇn víi CH2Cl2 - lo¹i dung m«i
CÆn Y (153 g)
- s¾c kÝ cao clorofom
- Dung m«i CH2Cl2-MeOH
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất A
3.1.1 Phân lập chất A
Tiến hành sắc kí cao colorofom (125 g) trên cột silicagel (63-200 μm, 3x50 cm) với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH có 4% dung dịch NH3, gradient (0-100%) được 35 phân đoạn (F1-F35). Từ phân đoạn F8 (13 g) chạy cột sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH (1/9) loại bỏ chất màu thu được 16 phân đoạn (F8.1-F8.16). Từ phân đoạn F8.7 (235 mg) chạy cột silicagel (40-63 μm, 2x50 cm) với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH gradient (0-100%) thu được 19 phân đoạn (F8.7.1-F8.7.19) Từ phân đoạn F8.7.6 (32 mg) dùng bản mỏng điều chế với hệ dung môi benzen-MeOH (9/1) có 4% dung dịch NH3
thu được chất A (15 mg).
3.1.2. Xác định cấu trúc chất A (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chất A được phân lập dưới dạng rắn màu trắng. Tan tốt trong diclometan, metanol.
Phổ hồng ngoại có đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm NH ở νmax 3250 cm-1 và liên kết đôi ở νmax 1590 cm-1.
3.1.2.1. Phổ khối lượng (ESI-MS)
Trên phổ khối ESI-MS, pic ion phân tử proton hóa [M+H]+được quan sát tại
m/z 284 [M+H]+ và pic ion phân tử proton hóa [M+H]-được quan sát tại m/z 282 [M+H]-. Từ đó cho biết hợp chất A có khối lượng phân tử là 283, tương ứng với công thức phân tử C17H17O3N.
3.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR cho thấy có tín hiệu của 4 proton vòng thơm ở δH 8,14 (1H, d, J=8,0 Hz, H-11), 7,20 (1H, t, J=7,5 Hz, H-10), 7,14 (1H, d,
J=7,5 Hz, H-8), 7,09 (1H, td, J=8,0; 1,0 Hz, H-9) và 1 nhóm metoxy ở δH 3,65 (3H, s, OCH3-1).
Ngoài ra trên phổ 1H-NMR còn có tín hiệu của 6 proton thuộc 3 nhóm metylen cũng được quan sát thấy ở δH 3,36 (1H, m, Hα-5), 2,89 (1H, m, Hβ-5), 2,77 (1H, dd, J=14,0; 5,0 Hz, Hα-7), 2,69 (2H, m, CH2-4), 2,65 (1H, t, J=13,5 Hz, Hβ- 7). Phổ 1H-NMR có tín hiệu của 1 proton metin dưới dạng hai doublet ở δH 3,75 (1H, dd, J=14,0; 4,5 Hz, H-6a).
Như vậy phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của A tìm thấy 14 nguyên tử hiđro liên kết với cacbon.
Bảng 3.1. Bảng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của A. Số C δH (ppm) J (Hz) 1 C OCH3 3,65 3H(s) 1a C 1b C 2 C 3 C 3a C 4 CH2 2,69 2H 5 CH2 3,36 1H(m) 2,89 1H (m) 6 CH 3,75 1H(dd, J=14,0; 4,5 Hz) 6a C 7 CH2 2,77 1H(dd, J=14,0; 5,0 Hz) 2,65 1H( t, J=13,5 Hz) 7a C 8 CH 7,14 1H (d, J=7,5 Hz) 9 CH 7,09 1H (td, J=8,0; 1,0 Hz) 10 CH 7,20 1H (t, J=7,5 Hz) 11 CH 8,14 1H (d, J=8,0 Hz) 11a C
3.1.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
Phổ 13C-NMR của chất A cho thấy có tín hiệu của 17 nguyên tử cacbon với số liệu: Ta có bảng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của A như sau:
Bảng 3.2. Bảng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của A
Số C δC (ppm) 1 C 138,7 OCH3 61,1 1a C 118,5 1b C 132,7 2 C 148,7 3 C 146,5 3a C 116,1 4 CH2 23,4 5 CH2 42,7 6a CH 53,9 7 CH2 37,2 7a C 135,2 8 CH 127,7 9 CH 126,4 10 CH 126,9 11 CH 127,3 11a C 132,3
3.1.2.5. Phổ DEPT
- Phổ DEPT 90 cho thâý A có 6 nhóm 4 nhóm metin sp2 ở δC 127,7 (C-8), 127,3 (C-11), 126,9 (C-10), 126,4 (C-9), 1 nhómmetin sp3 ở δC 53,9 (C-6a).
- Từ phổ DEPT 135 (phần trên) kết hợp với DEPT 90 ta thấy, ngoài các tín hiệu của nhóm CH thì DEPT 135 thấy sự có mặt của nhóm CH3 với các tín hiệu ở δC 61,1 của nhóm ( -OCH3 -1).
- Phổ DEPT 135 (phần dưới) có xuất hiện 3 tín hiệu, chứng tỏ trong phân tử có 3 nhóm metylen ở δC 42,7 (C-5), 37,2 (C-7), 23,4 (C-4).
- Dựa vào phổ DEPT và kết hợp với DEPT 90, DEPT 135 ta thấy A có 8 cacbon bậc 4 sp2 ở δC 148,7 (C-2), 146,5(C-3), 138,7 (C-1), 135,2 (C-7a), 132,7(C-1b), 132,3 (C-11a),118,5 (C-1a), 116,1 (C-3a).
Bảng 3.3. Bảng số liệu phổ DEPT của chất A. Số C δC (ppm) δH(ppm) 1 C 138,7 OCH3 61,1 3,65 1a C 118,5 1b C 132,7 2 C 148,7 3 C 146,5 3a C 116,1 4 CH2 23,4 2,69 5 CH2 42,7 3,36 và 2,89 6a CH 53,9 3,75 7 CH2 37,2 2,77và 2,65 7a C 135,2 8 CH 127,7 7,14 9 CH 126,4 7,09 10 CH 126,9 7,20 11 CH 127,3 8,14 11a C 132,3
Vậy kết hợp phổ 13C-NMR và DEPT của chất A cho thấy chất A có 17 nguyên tử cacbon tương ứng với 1 nhóm metoxy, 3 nhóm metylen, 4 nhóm metin sp2, 1 nhómmetin sp3 và 8 cacbon bậc 4 sp2 .
Độ chuyển dịch hóa học của nhóm metin CH-6a và nhóm metylen CH2-5 cho thấy chúng liên kết với nguyên tử nitơ.
3.1.2.6. Phổ HMBC
Phân tích các dữ liệu phổ một chiều cho thấy hợp chất A có chứa 2 vòng benzen thế (1 vòng thế 6 vị trí và 1 vòng có 2 nhóm thế ở vị trí orto). Từ các phân tích trên đây, cho phép giả thiết hợp chất A thuộc khung noraporphin.
Hợp chất A thuộc khung noraporphin được khẳng định thông qua phân tích phổ hai chiều, đặc biệt là phổ HMBC.
Nhóm metoxy ở δC 61,1 được xác định liên kết tương ứng với C-1 của vòng A nhờ sự xuất hiện tương tác giữa chúng trên phổ HMBC. Tương tác HMBC giữa C-4 (δC 23,4 ) với C-1b (δC 132,7) và C-5 (δC 42,7) với H-6a (δH 3,75 ) cho phép xác định sự có mặt của vòng B. Tương tự, vòng C được khẳng định nhờ tương tác HMBC của C-8 (δC 127,7) và C-11a (δC 132,3) với các proton của nhóm metylen CH2-7 (δH 2,77 (1H, dd, J=14,0; 5,0 Hz, Hα-7), 2,65 (1H, t, J=13,5 Hz, Hβ-7)).
3.1.2.8. Phổ COSYGP
Phổ COSYGP của hợp chất A cho biết tương tác giữa H-H: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết hợp các số liệu phổ khối, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSYGP cho thấy chất A có công thức cấu tạo là:
NH HO H3CO 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 3a 6a 7a A B C D OH 1a 1b 11a
Có tên IUPAC là: 2,3-dihydroxy-1-metoxy-noraporphin hay còn gọi là 2,3-dihydroxynornuceferin.
3.2.Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất B
3.2.1.Phân lập chất B
Tiến hành sắc kí cao colrofom (125 g) trên cột silicagel (63-200 μm, 3x50 cm) với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH có 4% dung dịch NH3, gradient (0-100%) được 35 phân đoạn (F1-F35). Từ phân đoạn F8 (13 g) chạy cột sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH (1/9) loại bỏ chất màu thu được 16 phân đoạn (F8.1-F8.16). Từ phân đoạn F8.12 (150 mg) chạy cột silicagel (40-63 μm, 2x50 cm) với hệ dung môi CH2Cl2- MeOH gradient (0-70%) thu được chất B (17 mg).
3.2.2 Xác định cấu trúc chất B
Chất B được phân lập dưới dạng rắn màu trắng. Tan tốt trong diclometan, metanol.
3.2.2.1.Phổ khối lượng (ESI-MS)
Trên phổ khối ESI-MS, pic ion phân tử proton hóa [M+H]+được quan sát tại
m/z 324 [M+H]+ và pic ion phân tử proton hóa [M+H]-được quan sát tại m/z 322 [M+H]- .Từ đó cho biết hợp chất B có khối lượng phân tử là 323, tương ứng với công thức phân tử C18H13NO5.
3.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
Trên 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): Có tín hiệu của 6 proton của 2 nhóm metoxy ở δH 3,99 (3H, s, OCH3-10), 3,85 (3H, s, OCH3-2). Ngoài ra trên vùng trường thấp còn có tín hiệu của 5 proton vòng thơm ở δH 8,75 (d, J = 5,0 Hz, H-5), 8,14 (d, J = 8,5 Hz, H-8), 7,76 (d, J = 5,0 Hz, H-4), 7,23 (s, H-3) và 7,12 (d, J =
8,5 Hz, H-9).
Có tín hiệu của 2 proton vòng thơm với hằng số tương tác J = 8,5 Hz ở δH
8,14 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8) và 7,12 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-9) chứng tỏ rằng chúng nằm ở vị trí orto với nhau.
Như vậy phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của B có 11 nguyên tử hiđro liên kết với Cacbon.
Bảng 3.4. Bảng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của B. Số C δH (ppm) J (Hz) 1 C 2 OCH3 3,85 3H 3 CH 7,23 1H(s) 3a C 4 CH 7,76 1H(d, j=5,0Hz) 5 CH 8,75 1H(d, J = 5,0 Hz) 6a C 7 C 7a C 8 CH 8,14 1H(d, J = 8,5 Hz) 9 CH 7,12 1H (d, J =8,0 Hz) 10 OCH3 3,99 3H
3.2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR
Qua phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) ta thấy : Phổ 13C-NMR của chất B cho thấy có tín hiệu của 18 nguyên tử cacbon với số liệu:182,0 (C-7), 156,0 (C-1), 155,1 (C- 10), 146,5 (C-2), 145,2 (C-11), 144,8 (C-5), 136,0 (C-6a), 126,2 (C-7a), 123,6 (C- 8), 123,6 (C-1a), 122,9 (C-4), 122,9 (C-1b), 121,9 (C-3a), 120,4 (C-11a), 111,6 (C- 9), 106,1 (C-3), 63,3 (OCH3-2), 56,3 (OCH3-10).
Bảng 3.5. Bảng số liệu số liệu phổ 13C -NMR của hợp chất B. Số C δC (ppm) 1 C 156,0 1a C 123,6 1b C 122,9 2 C 146,5 OCH3 63,3 3 CH 106,1 3a C 121,9 4 CH 122,9 5 CH 144,8 6a C 136,0 7 C 182,0 7a C 126,2 8 CH 123,6 9 CH 111,6 10 C 155,1 OCH3 56,3 11 C 145,2 11a C 120,4
3.2.2.4. Phổ DEPT
- Phổ DEPT 90 cho thấy B có 5 nhóm metin sp2 ở δC 144,8 (C-5), 123,6 (C-8), 122,9 (C-4), 111,6 (C-9), 106,1 (C-3).
- Từ phổ DEPT 135 (phần trên) kết hợp với DEPT 90 ta thấy, ngoài các tín hiệu của nhóm CH thì DEPT 135 thấy sự có mặt của nhóm CH3 với các tín hiệu ở δC 63,3 (OCH3-2), 56,3 (OCH3-10) của 2 nhóm.
- Phổ DEPT 135 (phần dưới) không xuất hiện các tín hiệu, chứng tỏ trong phân tử không có nhóm metylen .
- Dựa vào phổ DEPT và kết hợp với DEPT 90, DEPT 135 ta thấy B có 11 cacbon bậc 4 sp2 ở δC 182,0 (C-7), 156,0 (C-1), 155,1 (C-10), 146,5 (C-2), 145,2 (C-11), 136,0 (C-6a), 126,2 (C-7a), 123,6 (C-1a), 122,9 (C-1b), 121,9 (C-3a), 120,4 (C- 11a).
Bảng 3.6. Bảng số liệu phổ DEPT của hợp chất B. Số C δC (ppm) δH (ppm) 1 C 156,0 1a C 123,6 1b C 122,9 2 C 146,5 OCH3 63,3 3,85 3 CH 106,1 7,23 3a C 121,9 4 CH 122,9 7,76 5 CH 144,8 8,75 6a C 136,0 7 C 182,0 7a C 126,2 8 CH 123,6 8,14 9 CH 111,6 7,12 10 C 155,1 OCH3 56,3 3,99 11 C 145,2 11a C 120,4
Vậy kết hợp phổ 13C-NMR và DEPT của chất B cho thấy chất B có 18 nguyên tử cacbon tương ứng với 2 nhóm metoxy, 5 nhóm metin sp2 và 11 cacbon bậc 4 sp2 .
Độ chuyển dịch hóa học của H-4 và H-5 và hằng số tương tác giữa chúng (J
3.2.2.5. Phổ HSQC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});