PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
2.4.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế, tiêu diệt nấm Saprolegnia sp
bằng một số hóa chất trong phòng thí nghiệm
Quá trình xác định nồng độ của hóa chất thí nghiệm diệt nấm Saprolegnia sp
được thể hiện ở sơ đồ sau:
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu thử nghiệm khả năng diệt nấm của hóa chất Nấm Saprolegnia đã được phân loại
H2O2 Castellenin
Acid acetic Đối chứng
NĐ 1 NĐ 2 NĐ 3
Đánh giá khả năng ức chế nấm của hóa chất thử nghiệm Đánh giá khả năng tiêu diệt nấm của hóa chất thử nghiệm
Iodine TCCA
NĐ n
• Thí nghiệm 1: Thí nghiệm sàng lọc các nồng độ hóa chất
Thí nghiệm được bố trí ở các đĩa peptri đã được khử trùng.
Bước 1: Hóa chất thí nghiệm gồm Acid acetic, Castelleni, H2O2 và PVP - Iodine được pha loãng bằng nước cất khử trùng theo tỷ lệ 100%, 50%, 25%, 15%, 5%, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung hóa chất.
Bước 2: Nấm thuần Saprolegnia được nuôi cấy ở môi trường tăng sinh GY broth. Sau 24 giờ dùng kéo, panh vô trùng cắt nhỏ sợi nấm rồi rửa sạch trong nước cất khử trùng 3 lần. Cho sợi nấm vào dung dịch có chứa hóa chất ở những nồng độ tương ứng được pha loãng ở bước 1 với thời gian thử nghiệm là 5 phút, 10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 50 phút, 60 phút.
Bước 3: Sợi nấm ngâm trong dung dịch hóa chất với thời gian thử nghiệm tương
ứng được lấy ra và nuôi cấy trên môi trường GY agar. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 20oC. Đọc kết quả: Trong quá trình tiến hành thí nghiệm thường xuyên quan sát, thu mẫu và kiểm tra. Xác định nồng độ thấp nhất của hóa chất thử nghiệm có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Saprolegnia sp để làm thí nghiệm thứ 2.
• Thí nghiệm 2: Xác định các nồng độ diệt nấm tối thiểu
Từ kết quả thí nghiệm 1, xác định được nồng độ thấp nhất ức chế khả năng phát triển của nấm. Nồng độ này được pha ở những nồng độ khác nhau từ 100ppm - 1500ppm (tùy từng loại hóa chất) dùng để tiến hành thí nghiệm 2. Riêng với TCCA theo chỉ dẫn của nhà sản xuất và điều kiện thí nghiệm cho phép thử nghiệm với 2 hình thức ở nồng độ 4ppm - 8ppm trong thời gian 10 phút, 30 phút, 60 phút và nồng độ 0,2ppm - 0,6ppm trong thời gian 2 giờ, 12 giờ, 24 giờ.
Sau khi pha loãng nồng độ hóa chất, cho sợi nấm vào hóa chất thử nghiệm ở những nồng độ đã được pha loãng với thời gian thử nghiệm là 10 phút, 30 phút, 60 phút, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Các nghiệm thức đối chứng không bổ sung hóa chất. Sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày đọc kết quả.
Những nồng độ thấp nhất mà sau 7 ngày nấm không thể phát triển được là nồng độ diệt tối thiểu.