3. Đối tượng nghiờn cứu
2.1.2. Phương phỏp phõn lập cỏc hợp chất
Cỏc phương phỏp được sử dụng để phõn tớch, phõn lập trong quỏ trỡnh nghiờn cứu gồm:
- Sắc ký cột (CC)
- Sắc ký lớp mỏng (TLC)
- Cỏc phương phỏp kết tinh phõn đoạn
2.1.3. Phương phỏp khảo sỏt cấu trỳc cỏc hợp chất
Cấu trỳc cỏc hợp chất được xỏc định nhờ sự kết hợp cỏc phương phỏp phổ:
- Phương phỏp khối phổ
- Phương phỏp cộng hưởng từ hạt nhõn proton 1H - NMR.
- Phương phỏp cộng hưởng từ hạt nhõn cacbon 13C – NMR.
- Phương phỏp DEPT.
- Phổ hai chiều DMSO – COSYGP. - Phổ hai chiều DMSO – HSQC.
2.2. THỰC NGHIỆM2.2.1. Húa chất và thiết bị 2.2.1. Húa chất và thiết bị
2.2.1.1. Húa chất
Cỏc dung mụi để ngõm chiết mẫu thực vật đều dựng loại tinh khiết (pure), khi dựng cho cỏc loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phõn tớch (PA).
Dung mụi ngõm chiết: - Metanol (CH3OH)
- n - Hexan (n-C6H14) - Clorofom (CHCl3)
- Etylaxetat (CH3COOC2H5)
Dung mụi dựng sắc ký cột: Hệ dung mụi: clorofom – metanol.
2.2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
- Mỏy cụ quay chõn khụng, cột sắc ký, bỡnh cầu, ống nghiệm… - Cỏc phương phỏp sắc ký:
Sắc ký cột: Sử dụng silicagen 254 (Merck), cỡ hạt silicagen chạy cột là 0,04 – 0.06 mesh.
Sắc ký bản mỏng: Sắc ký bản mỏng phõn tớch được tiến hành trờn bản mỏng kớnh silicagen Merck 60 F254, độ dày 0,2 mm.
Hiện màu: hơi iot và đốn UV 254nm
Tinh chế cỏc hợp chất bằng kết tinh phõn đoạn, rửa trong cỏc dung mụi khỏc nhau.
- Cỏc phương phỏp phổ:
Phổ khối lượng EI–MS (positive, negative) được ghi trờn mỏy HP 5989B–MS của viện Húa học – Viện Khoa học Tự nhiờn và Cụng nghệ Quốc gia. Năng lượng bắn phỏ ở 70eV.
Phổ 1H –NMR được đo trờn mỏy BRUKER 500 MHz, dung mụi CDCl3.
Phổ 13C – NMR, DEPT, COSYGP, HSQC, HMBC được đo trờn mỏy
BRUKER 125 MHz dung mụi CDCl3 (Viện Húa học – Viện Khoa học Tự
nhiờn và Cụng nghệ Quốc gia).
2.2.2. Nghiờn cứu tỏch hợp chất từ quả cõy giỏc đế miờn (Goniothalamus tamirensis Pierre) - Họ Na
Lỏ và quả cõy giỏc đế miờn thu hỏi ở Quỳ Chõu – Nghệ An vào thỏng 6/2009, được ThS. Đào Đỡnh Cuờng và ThS. Nguyễn Quốc Bỡnh định tờn. Mẫu tiờu bản cú tờn VN 1087 được lưu giữ tại Viện Sinh thỏi và Tài nguyờn Sinh vật – Viện KH&CN VN.
Quả tươi được rửa sạch, phơi khụ nhẹ trong búng rõm, tỏn nhỏ, ngõm với metanol khoảng 30 ngày. Cất thu hồi dung mụi được cao metanol.
Chiết lần lượt cao metanol với dung mụi cú độ phõn cực tăng dần n - Hexan, clorofom, etylaxetat, metanol thu hồi cỏc cao tương ứng.
Cao clorofom được phõn tớch bằng sắc ký cột:
Hệ dung mụi rửa giải clorofom: metanol = 100%: 0% đến 0%: 100%thu được 18 phõn đoạn.
- Phõn đoạn 8 được phõn tớch bằng sắc ký cột với hệ dung mụi rửa giải clorofom: metanol = 100%: 0% đến 40%: 60% thu được 7 phõn đoạn.
- Phõn đoạn F 8.3 thu chất rắn màu trắng. Tinh chế và kết tinh lại nhiều lần bằng cỏc dung mụi khỏc nhau thu được chất A.
Phõn đoạn F 8.6 dựng bản mỏng điều chế thu chất rắn màu trắng. Tinh chế và kết tinh lại nhiều lần bằng cỏc dung mụi khỏc nhau thu được chất B
Quả ( 2kg khô )
Cao metanol (305g)
Cao n - hexan
(50g) Cao etylaxetat (105g) Dịch nước
- ngâm trong metanol - Chưng cất loại metanol
Chiết lần lượt với các dung môi sau: - n- hexan - clorofom - etylaxetat SKC Cao clorofom (87g) A B
Sơ đồ : Quỏ trỡnh ngõm, chiết, tỏch hợp chất từ quả cõy giỏc đế miờn (Goniothalamus tamirensis pierre)
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định cấu trúc hợp chất A
Mẫu quả khụ được ngõm trong 10 lớt metanol trong 30 ngày. lọc và cất
hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được 305 gam cao metanol. Chiết lần
lượt cao metanol với dung mụi cú độ phõn cực tăng dần n - Hexan, clorofom, etylaxetat, metanol thu hồi cỏc cao tương ứng.
Cao clorofom được phõn tớch bằng sắc ký cột:
Hệ dung mụi rửa giải clorofom: metanol = 100%: 0% đến 0%: 100%thu được 18 phõn đoạn.
- Phõn đoạn F 8.3 thu chất rắn màu trắng. Tinh chế và kết tinh lại nhiều lần bằng cỏc dung mụi khỏc nhau thu được chất A.
Chất A là một chất rắn màu trắng. Phần trăm cỏc nguyờn tố trong phõn tử: C 81,81%; H 10,91%, O 7,28%.
3.1.1. Phổ ESI – MS của hợp chất A
Phụ̉ khụ́i lươ ̣ng phun mù electron(ESI-MS) negtive [M+H]+ cho pic 221. Phụ̉ khụ́i lươ ̣ng phun mù electron (ESI-MS) positive [M-H]- cho pic 219. Vậy khối lượng phõn tử của chất A là 220 tương ứng với cụng thức phõn tử là C15H24O.
3.1.2. Phổ 1H - NMR của hợp chất A:
Ở phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 4,69 (1H, s, H-14a); 4,66 (1H, s, H-14b); 2,42 (1H, dd, J = 6,0; 13,5 Hz, H-9b); 2,20 (1H, m, H-1); 2,04 (1H, t, J=13,0 Hz, H-9a); 1,96 (1H, m, H-8b); 1,91 (1H, m, H-2b); 1,77 (1H, m, H- 3b); 1,64 (1H, m, H-2a); 1,56 (1H, m, H-3a); 1,31 (1H, t, J=10,5 Hz, H-5); 1,28 (3H, s, Me-15); 1,06 (3H, s, Me-12); 1,04 (3H, s, Me-13); ; 1,02 (1H, m, H-8a); 0,71 (1H, ddd, J=6,0; 9,5; 11,0 Hz, H-7); 0,47 (1H, dd, J=9,5; 11,0 Hz, H-6).
Trờn phổ 1H-NMR ở vựng trường thấp cú tớn hiệu cộng hưởng của hai
proton olefin ở δH =4,66 (1H, s, Ha-14); δH = 4,69 (1H, s, Hb-14), cỏc tương tỏc trờn phổ HSQC cho biết hai proton này thuộc về một nhúm metylen olefinic.
Ở vựng trường cao cũng xuất hiện tớn hiệu rất đặc trưng của 2 proton cyclopropane ở δH = 0,47 (1H, dd, J=9,5; 11,0 Hz, H-6); 0,71 (1H, ddd, J=6,0; 9,5; 11,0 Hz, H-7) và 3 nhúm metyl ở δH 1,04 (3H, s, CH3-13); 1,06 (3H, s, CH3-14) và 1,28 (3H, s, CH3-15), dựa vào giỏ trị của hằng số tương tỏc spin- spin giữa proton H-6 và H-7 (J=9,5 Hz), chỳng tụi đi đến kết luận vũng cyclopropan cú dạng đồng phõn hỡnh học cis. 3.1.3. Phổ 13C - NMR của hợp chất A: Ở phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ (ppm):153,5 (C-10); 106,2 (C- 14); 81,0 (C-4); 54,4 (C-5); 53,4 (C-1); 41,7 (C-3); 38,9 (C-9); 29,9 (C-6); 28,6 (CH3-12); 27,5 (C-7); 26,7 (C-2); 26,1 (CH3-15); 24,8 (C-8); 20,2 (C- 11); 16,3 (CH3-13).
Nhỡn vào phổ DEPT của hợp chất A ta thấy:
- Phổ DEPT 90 cho thõý A cú 4 nhúm CH, trong đú tớn hiệu tại δ =53,4 ppm tương ứng với (C-1); tớn hiệu tại δ =54,4 ppm tương ứng với (C-5); tớn hiệu tại δ = 29,9 ppm tương ứng với (C-6); tớn hiệu tại δ = 27,5 ppm tương ứng với (C-7).
- Từ phổ DEPT 135 (phần trờn) kết hợp với DEPT 90 ta thấy, ngoài cỏc tớn hiệu của nhúm CH thỡ DEPT 135 thấy sự cú mặt của 3 nhúm -CH3 ở cỏc vị trớ sau: tớn hiệu tại δ =28,6 ppm tương ứng với (CH3-12); tớn hiệu tại δ
=26,1ppm tương ứng với (CH3-15); tớn hiệu tại δ = 16,3 ppm tương ứng với (CH3-13).
- Phổ DEPT 135 (phần dưới) xuất hiện cỏc tớn hiệu sau: tớn hiệu tại δ = 106,2 ppm tương ứng với (-CH2-14); tớn hiệu tại δ = 41,7 ppm tương ứng với (-CH2- 3); tớn hiệu tại δ = 38,9 ppm tương ứng với (-CH2- 9) ); tớn hiệu tại δ = 26,7 ppm tương ứng với (-CH2- 2) ; tớn hiệu tại δ = 24,8 ppm tương ứng với (-CH2- 8), chứng tỏ trong phõn tử cú 5 nhúm -CH2-.
Dựa vào phổ DEPT và kết hợp với DEPT 90, DEPT 135 ta thấy A cú 3 C khụng liờn kết với H tại δ= 153,5 (C-10); 81,0 (C-4); 20,2 (C-11).
3.1.5. Phổ COSYGP của hợp chất A:
Phổ COSYGP của hợp chất A cho biết tương tỏc giữa H-H: H7-H6, H8a-H7, H5-H6, H7-H8b, H8a – H8b, H9a-H8b, H1-H5, H1-H2a, H2a-H2b, H3a-H3b, H2a-H3a, H1-H2b, H9a-H9b, H6-H7, H7-H8a, H6-H5, H8b-H7, H8b – H8a, H8b-H9a, H5-H1, H2a-H1, H2b-H2a, H3b-H3a, H3a-H2a, H2b- H1, H9b-H9a.
Phổ HSQC thể hiện sự tương tỏc gần giữa C-H, cụ thể như sau: C13- H13, C8-H8a, C8-H8b, C12-H12, C2-H2a, C2-H2b, C7-H7, C15-H15, C6- H5, C6-H6, C9-H9b, C9-H9a, C3-H3a, C3-H3b, C1-H1, C5-H5, C14-H14a, C14-H14b.
Phổ HMBC cho thấy sự tương tỏc xa giữa C-H. Cụ thể như sau: C6- H1, C9-H8b, C6-H8b, C7-H9a, C5-H3b, C15-H3b, C5-H2a, C15-H3a, C5- H13, C3-H5, C6-H12, C9-H8a, C6-H13, C7-H12, C7-H13, C11-H8, C11- H12, C12-H7, C12-H6, C1-H14, C9-H14, C1-H9b, C7-H9b, C10-H9b, C14- H9b, C14-H1, C3-H9a, C10-H8b, C4-H2, C10-H5, C4-H15, C10- H8a.
Từ đú, ta cú bảng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR của A
như bảng sau: TT C δH (ppm) δH (ppm) tài liệu 1 CH 2,20 (1H, m, H-1) 2 CH2 1,64 (1H, m, H-2a); 1,91 (1H, m, H-2b) 3 CH2 1,56 (1H, m, H-3a); 1,77 (1H, m, H-3b) 4 C 5 CH 1,31 (1H, t, J=10,5 Hz, H-5) 6 CH 0,47 (1H, dd, J=9,5; 11,0 Hz, H- 6) 0,47 (1H,d, J=9Hz) (H-6 và H-7) 7 CH 0,71 (1H, ddd, J=6,0; 9,5; 11,0 Hz, H-7) 8 CH2 1,96 (1H, m, H-8b); 1,02 (1H, m, H-8a) 9 CH2 2,42 (1H, dd, J = 6,0; 13,5 Hz, H- 9b) 2,04 (1H, t, J= 13,0 Hz, H-9a) 10 C 11 C 12 CH3 1,06 (3H, s, Me-12) 1,05 (3H, s) (Me-12 và Me -13) 13 CH3 1,04 (3H, s, Me-13) 14 CH2 4,69 (1H, s, H-14a); 4,66 (1H, s, 4,67 (2H, d, J=5 Hz,
H-14b) H-14
15 CH3 1,28 (3H, s, Me-15) 1,28 (3H, s, Me-15)
Ta cú bảng số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C-NMR của A như bảng sau: TT C δC(ppm) δC(ppm) 1 CH 53,4 (C-1) 26,1 (d) 2 CH2 26,7 (C-2) 38,3 (t) 3 CH2 41,7 (C-3) 24,8 (t) 4 C 81,0 (C-4) 81,0 (s) 5 CH 54,4 (C-5) 28,6 (d) 6 CH 29,9 (C-6) 53.4 (d) 7 CH 27,5 (C-7) 54,3 (d) 8 CH2 24,8 (C-8) 26,7 (t) 9 CH2 38,9 (C-9) 41,7 (t) 10 C 153,5 (C-10) 154,7 (s) 11 C 20,2 (C-11) 29,9 (s) 12 CH3 28,6 (CH3-12) 29,9 (q) 13 CH3 16,3 (CH3-13) 27,5 (q) 14 CH2 106,2 (C-14) 109,8 (t) 15 CH3 26,1 (CH3-15) 16,3 (q)
Cỏc dữ liệu phổ trờn rất đặc trưng cho sesquitecpen dạng
aromadendrane cú 1 nhúm exo-metylen trong phõn tử. Tớn hiệu của 2 nhúm
metin và 4 nhúm metylen cũn lại đều xuất hiện ở vựng trường cao nằm trong khoảng từ δH =1,00 đến δH =2,42. Kết hợp cỏc dữ kiện phổ MS, 1H-NMR, 13C- NMR, DEPT, HSQC, COSY, HMBC và so sỏnh với tài liệu tham khảo [18,21] cho phộp xỏc định cấu trỳc của chất A chớnh là spathulenol.
Cú cụng thức cấu tạo như sau: OHH H 2 3 4 5 6 7 8 9 10 14 11 1 13 12 15
Spathulenolchất này lần đầu tiờn phõn lập được từ quả của cõy giỏc đế miờn.
3.2 Xỏc định cấu trỳc hợp chất B
Cao clorofom được phõn tớch bằng sắc ký cột:
Hệ dung mụi rửa giải clorofom: metanol = 100%: 0% đến 0%: 100%thu được 18 phõn đoạn.
Phõn đoạn 8 được phõn tớch bằng sắc ký cột với hệ dung mụi rửa giải clorofom: metanol = 100%: 0% đến 40%: 60% thu được 7 phõn đoạn.
Phõn đoạn F 8.6 dựng bản mỏng điều chế thu chất rắn màu trắng. Tinh chế và kết tinh lại nhiều lần bằng cỏc dung mụi khỏc nhau thu được chất B.
Chất B là một chất rắn màu vàng, cú nhiệt độ núng chảy là 128 -1300C, cú cụng thức phõn tử C14H12O3 ( C 73,68%, H 5,30%, O 21,02%)
3.2.1. Phổ EI – MS của hợp chất B
Phụ̉ khụ́i lươ ̣ng phun mù electron(ESI-MS) negtive [M+H]+ cho pic 229. Phụ̉ khụ́i lươ ̣ng phun mù electron (ESI-MS) positive [M-H]- cho pic 227. Vậy khối lượng phõn tử của chất B là 228 tương ứng với cụng thức phõn tử là C14H12O3
Hỡnh 3.19 : Phụ̉ khụ́i lươ ̣ng phun mù electron (ESI-MS) positive [M-H]- của chất B
Hỡnh 3.20 : Phụ̉ khụ́i lươ ̣ng phun mù electron(ESI-MS) negtive [M+H]+
3.2.2. Phổ 1 H-NMR của hợp chất B
Phổ 1H –NMR cho thấy ở hợp chất B cho 3 tớn hiệu singlet trong đú tớn hiệu singlet ở δ = 1.5 ppm tương ứng với 6 hiđro ở (H-11; H-12) của 2 nhúm CH3, tớn hiệu singlet tại δ =6.81 ppm tương ứng với 2 hiđro ở (H-5; H-10). Tớn hiệu doublet ở δ = 5,69 ppm tương ứng gỏn cho 1 hiđro ( 5,69 ( d, 10,0 Hz) H-7); tớn hiệu doublet ở δ = 6,20 ppm tương ứng gỏn cho 1 hiđro ( 6,20 (d, 9,5 Hz) H-3); tớn hiệu doublet ở δ = 6,31 ppm tương ứng gỏn cho 1 hiđro (
6,31 ( d, 10,0 Hz) H-6); tớn hiệu doublet ở δ = 7,54 ppm tương ứng gỏn cho 1 hiđro ( 7,54 ( d, 9,5 Hz) H-4). Như vậy phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR của B tỡm thấy 12 nguyờn tử hiđro.
3.2.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất B
Ở phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của hợp chất B ta thấy cỏc tớn hiệu
δ (ppm):160,5 (C-2); 149,3 (C-9a); 148,3 (C-10a); 143,6 (C-4); 135,6 (C-10); 131,2 (C-7); 121,1 (C-6); 119,1 (C-5, C-5a); 113,2 (C-3); 113,0 (C-4a); 77,7 (C-8); 28,1 (C-11; C-12 (CH3-))
3.2.4. Phổ DEPT của hợp chất B
- Phổ DEPT 90 cho thõý B cú 6 nhúm CH, trong đú tớn hiệu tại δ =143.5 ppm (C-4); δ =135.6 ppm (C-10); tớn hiệu tại δ = 131.2 ppm (C-7); tớn hiệu tại δ
=121,0 ppm (C-6); tớn hiệu tại δ =119,0 ppm (C-5) và tớn hiệu tại δ =113.1 ppm (C-3).
- Từ phổ DEPT 135 (phần trờn) kết hợp với DEPT 90 ta thấy, ngoài cỏc tớn hiệu của nhúm CH thỡ DEPT 135 thấy cú tớn hiệu tại δ = 28.1 ppm chứng tỏ
sự cú mặt của 2 nhúm CH3
- Phổ DEPT 135 (phần dưới) khụng xuất hiện vạch nào, chứng tỏ trong phõn tử khụng cú nhúm CH2.
Dựa vào phổ DEPT và kết hợp với DEPT 90, DEPT 135 ta thấy B cú 6 C khụng liờn kết với H tại δ= 160.5 ppm (C-2); δ =149.3 ppm (C-9a); δ
=148.3 ppm (C- 10a); δ=119.0 ppm (C-5a); δ= 112.9 ppm (C-4a). Vậy B cú cụng thức phõn tử là C14H12O3
3.2.5. Phổ HMBC hợp chất B
Phổ HMBC cho thấy sự tương tỏc xa giữa C-H. Cụ thể như sau: C2-H4; C2- H3; C10a-H4; C10a-H5; C9a-H6; C4-H5; C10-H5; C10-H4; C7-H11; C7- H12; C5-H4; C5-H6; C6-H5; C5a-H7; C6-H11; C3-H4; C4a-H4; C4a-H6;
Hỡnh 3.27 : Phổ HMBC hợp chất B
Phổ HSQC thể hiện sự tương tỏc gần giữa C-H, cụ thể như sau: C4-H4; C6-H6; C7-H7; C12-H12; C3-H3; C11- H11; C5a-H6; C5-H5.
Từ số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR của B như bảng sau:
TT C δH(ppm) δH(ppm) tài liệu 1 O 2 C 3 CH 6,20 ( d, 9,5 Hz) 6,22 (1H, d, J=9,6 Hz) 4 CH 7,54 ( d, 9,5 Hz) 4a C 5 CH 6,81 7,07 (1H, s) 5a C 6 CH 6,31 ( d, 10,0 Hz) 6,34 (1H, d, J= 9,9 Hz) 7 CH 5,69 ( d, 10,0 Hz) 5,68 (1H, d, J=9,9 Hz) 8 C 9 O 9a C 10 CH 6,81 6,72 (1H, s) 10a C 11 CH3 1,5 ( s ) 1,47 (6H, S, 2 x CH3) 12 CH3 1,5 ( s )
Từ phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C-NMR của B như bảng số liệu như sau sau:
TT δC (ppm) δC (ppm) tài liệu 1 O 2 C 160,5 161.2 3 CH 113,1 104.6 4 CH 143,5 143.4 4a C 112,9 112.9 5 CH 119,0
118.6 5a C 119,0 6 CH 121,0 120.9 7 CH 131,2 131.3 8 C 77,7 77.9 9 O 9a C 149,3 156.9 10 CH 135,6 113.2 10a C 148,3 155.5 11 CH3 28,1 28.7 (2Me) 12 CH3 28,1
Kết hợp cỏc số liệu phổ khối, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSYGP so sỏnh với tài liệu [17,20] cho thấy chất B cú tờn Xanthyletin (tờn theo IUPAC là: 8,8-dimethyl-2H,8H benzo[1,2-b;5,4-b'] dipyran-2-one) Cú cụng thức cấu tạo là:
O O O 1 2 3 4 4a 5 5a 6 7 8 9 9a 10 10a
Xanthyletin là chất mà lần đầu phõn lập được từ quả của cõy giỏc đế miờn ở Quỳ Chõu, Nghệ An.
KẾT LUẬN
Nghiờn cứu thành phần húa học của quả cõy giỏc đế miờn ở Quỳ Chõu - Nghệ An chỳng tụi thu được những kết quả sau:
* Bằng cỏc phương phỏp ngõm chiết với cỏc dung mụi chọn lọc rồi cất