VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.3.Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real time PCR
Nested PCR và so sánh với kết quả đã xét nghiệm trước đĩ bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Số bản sao ban đầu của WSSV được định lượng dựa trên đường chuẩn và cho kết quả ở bảng số liệu xuất kết quả sau khi chạy mẫu.
3.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR PCR
Mục đích
Khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của phương pháp Real - time PCR.
Tiến hành
Chọn ngẫu nhiên hai mẫu nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức độ nặng từ thí nghiệm 2, tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, pha lỗng dịch tách chiết ADN của hai mẫu này theo hệ số pha lỗng bậc 10 (giống như tiến hành pha lỗng mẫu ở thí nghiệm 1) được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 100
đến 10-3. Thực hiện phản ứng Real - time PCR ở các nồng độ pha lỗng của cả hai mẫu: ở nồng độ bắt đầu pha lỗng (100) và ở mỗi nồng độ pha lỗng (10-1
, 10-2, 10-3) tiến hành lặp lại 3 lần. Khi thực hiện Real - time PCR, 5 chuẩn được chạy kèm để định lượng số bản sao của WSSV theo từng nồng độ pha lỗng. Ở từng nồng độ pha lỗng, 2 µl mẫu đã vortex được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng 48 µl hỗn hợp Real - time PCR.
Dựa vào các đường biễu diễn nồng độ huỳnh quang ở từng nồng độ trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, độ sai khác của các giá trị chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ, độ lệch chu kỳ ngưỡng trung bình và độ lệch giữa các số bản sao trung bình ở các nồng độ pha lỗng qua 3 lần lặp lại để xác định tính tuyến tính về khả năng định lượng của Real - time PCR. Căn cứ vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang ở 3 lần lặp lại của từng nồng độ mẫu pha lỗng, log số lượng bản sao ban đầu của mẫu ở từng nồng độ pha lỗng trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn, độ sai khác chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại ở cùng nồng độ pha lỗng, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu qua 3 lần lặp lại để xác định độ lặp lại về khả năng định lượng của Real - time PCR.