1.4.1. Nepofam
Hình 1.3. Cấu trúc của nefopam
Cơng thức phân tử: C17H19NO KLPT: 253,34. Tên khoa học: 3,4,5,6-tetrahydro-5-methyl-1-phenyl-1H-2,5-benzoxazocin.
1.4.1.1. Tính chất
NCH3 O
* 1
Bột tinh thể màu trắng. Tan trong nước, cloroform và methanol. Điểm chảy: từ 238 oC đến 242 oC.
Hằng số phân ly pKa = 9,2.
1.4.1.2. Hoạt tính sinh học
Nefopam thuộc nhĩm thuốc kháng viêm khơng steroid, được sử dụng làm thuốc giảm đau, hạ sốt, trị gout và các bệnh xương khớp [2].
Nhiều cơng trình nghiên cứu đã chứng minh rằng (+)-nefopam cĩ hoạt tính dược lực mạnh hơn hẳn (-)-nefopam (khoảng từ 7 - 30 lần) và hỗn hợp racemic. Cụ thể theo thứ tự (+) > (±) > (-). Trong khi đĩ, độc tính của đồng phân (+)-nefopam lại thấp hơn hoặc gần như khơng cĩ sự khác biệt với đồng phân (-)-nefopam và hỗn hợp racemic [65].
1.4.1.3. Các cơng trình phân tích đồng phân nefopam
- Kỹ thuật LC/MS: sử dụng cột bất đối CHIROBIOTIC V (pha tĩnh quang hoạt với chất nền là vancomycin) [33].
- Sắc ký điện động ái lực: sử dụng tác nhân quang hoạt là chondroitin sulfat A [27].
- Phương pháp CE với kỹ thuật CZE [32], [97]: dung dịch đệm phosphat pH 5 và tác nhân β-CD phosphat, dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tác nhân S-β-CD, dung dịch đệm borat pH 7,3 với tác nhân clindamycin phosphat.
1.4.2. Promethazin
Hình 1.4. Cấu trúc của promethazin
S N N CH3 CH3 CH3 * 1 10 2
Cơng thức phân tử: C17H20N2S KLPT: 284,4. Tên khoa học: (2RS)-N,N-dimethyl-1-(10H-phenothiazin-10-yl)propan-2-amin
1.4.2.1. Tính chất
Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Rất dễ tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96% và dicloromethan [1], [18], [90].
Điểm chảy: 222 oC kèm theo phân hủy Hằng số phân ly pKa = 9,1.
1.4.2.2. Hoạt tính sinh học
Promethazin là thuốc kháng histamin H1, cĩ tác dụng an thần, gây ngủ, chống nơn, kháng cholinergic, chống say tàu xe và tê tại chỗ. Ngồi ra, thuốc cịn cĩ tác dụng chống ho nhẹ [2].
1.4.2.3. Các cơng trình phân tích đồng phân promethazin
Trên thế giới đã cĩ những cơng trình tách đồng phân promethazin bằng các phương pháp HPLC [74], [100] và CZE. Trong phương pháp CZE, tác nhân quang hoạt sử dụng là 2-O-(2-hydoxybutyl)-β-CD trong dung dịch đệm phosphat pH 2,5 [98].
1.4.3. Ofloxacin
Hình 1.5. Cấu trúc của ofloxacin
Cơng thức phân tử: C18H20FN3O4 KLPT: 361,4. Tên khoa học: (RS)-9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-oxo-2,3- dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de]-1,4-benzoxazin-6-carboxylic acid.
N O N N CH3 CH3 OH F O O 1 2 *3 4 5 6 7 8 10 9
1.4.3.1. Tính chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bột mịn, khơng mùi, màu trắng ngà. Tan trong acid acetic và cloroform. Ít tan trong nước và methanol [1], [18], [90].
Điểm chảy: từ 200 oC đến 270 oC (kèm theo sự phân hủy). Gĩc quay cực từ - 0,1o đến + 0,1o.
Hằng số phân ly pKa = 7,9.
Ofloxacin cĩ khả năng phát quang tự nhiên như những fluoroquinolon khác.
1.4.3.2. Hoạt tính sinh học
Ofloxacin là kháng sinh thuộc nhĩm quinolon, tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), đặc biệt tác động trên trực khuẩn mủ xanh, tụ cầu và Chlamydia
trachomatis [2].
Levofloxacin là đồng phân L của ofloxacin, cĩ tác dụng diệt khuẩn mạnh gấp 8 - 128 lần so với đồng phân D và tác dụng mạnh gấp khoảng 2 lần so với hỗn hợp racemic. Levofloxacin cĩ tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn kỵ khí tốt hơn so với ofloxacin [2], [14].
1.4.3.3. Các cơng trình phân tích đồng phân ofloxacin
Trên thế giới đã cĩ một vài cơng trình nghiên cứu tách đồng phân ofloxacin bằng CZE với một số tác nhân như: methyl-β-CD, CM-β-CD, DM-β-CD, HP-β- CD [14], [83].
1.4.4. Miconazol
Hình 1.6. Cấu trúc của miconazol
Cl Cl O Cl Cl N N * 1 2
Cơng thức phân tử: C18H14Cl14N2O KLPT: 416,1. Tên khoa học:
1-[(2RS)-2-[(2,4-diclorobenzyl)oxy]-2-(2,4-diclorophenyl)ethyl]-1H-imidazol.
1.4.4.1. Tính chất
Bột màu trắng hoặc gần như trắng. Rấât khĩ tan trong nước, dễ tan trong methanol, tan trong ethanol 96% [1], [18], [90].
Gĩc quay cực từ - 0,10o đến + 0,10o. Hằng số phân ly pKa = 6,7.
1.4.4.2. Hoạt tính sinh học
Miconazol cĩ hoạt tính kháng nấm đối với vi nấm ngồi da và vi nấm men, cũng như cĩ hoạt tính kháng khuẩn đối với một số trực khuẩn và cầu khuẩn Gram (+) [2].
Những thử nghiệm sinh học ban đầu cho thấy (R)-miconazol cĩ hoạt tính kháng
nấm in vitro mạnh hơn đồng phân (S)-miconazol và hỗn hợp racemic trên các
chủng gây bệnh phổ biến như nấm Candida albicans, T. rubrum, T. lanosum và
A. Flavus [56].
1.4.4.3. Các cơng trình phân tích đồng phân miconazol
Phương pháp HPLC với cột sắc ký ChiralpaK AD-H [6]. Sắc ký lỏng siêu tới hạn [12].
Phương pháp CE:
- Tách bằng kỹ thuật MEKC với sự phối hợp của hai tác nhân β-CD và mono-3-
O-phenycarbamoyl-β-CD trong mơi trường đệm borat pH 9,0 [96].
- Tách bằng kỹ thuật CZE trong mơi trường đệm phosphat pH 3, sử dụng tác nhân HP-β-CD hoặc TM-β-CD [95], [98]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 1.7. Cấu trúc của ketoconazol.
Cơng thức phân tử: C26H28Cl2N4O4 KLPT: 531,4. Tên khoa học: 1-acetyl-4-[4-[[(2RS,4SR)-2-(2,4-diclorophenyl)-2-(1H-imidazol- 1-ylmethyl)1,3-dioxolan-4-yl]methoxy]phenyl]piperazin.
1.4.5.1. Tính chất
Bột trắng hoặc gần như trắng. Thực tế khơng tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan, tan trong methanol, hơi tan trong ethanol 96% [1], [18], [90]. Gĩc quay cực từ - 0,10o đến + 0,10o.
Hằng số phân ly pKa = 6,54.
1.4.5.2. Hoạt tính sinh học
Cũng như các dẫn chất azol kháng nấm khác, ketoconazol ức chế hoạt tính của cytochrom P450 là hệ enzym cần thiết cho quá trình khử methyl các 14 alpha - methyl - sterol thành ergosterol là sterol của màng tế bào nấm. Tác dụng kháng nấm của ketoconazol là do tác dụng hĩa lý trực tiếp của thuốc trên màng tế bào nấm [2]. Ketoconazol là thuốc kháng nấm phổ rộng, tác dụng trên nhiều loại nấm gây bệnh, thuốc cịn tác dụng trên một vài vi khuẩn Gram (+).
1.4.5.3. Các cơng trình phân tích đồng phân ketoconazol
Trong mơi trường đệm phosphat pH 3, đồng phân ketoconazol cĩ thể được tách với tác nhân TM-β-CD và HB-β-CD bằng kỹ thuật CZE [11], [12], [21], [98].
1.4.6. Amlodipin N O N CH3 O O O N N * * 1 2 3 4 5
Hình 1.8. Cấu trúc của amlodipin
Cơng thức phân tử: C20H25ClN2O5 KLPT: 408,9. Tên khoa học: (±) 3-ethyl-5-methyl-2-(2aminoethoxymethyl)-4-(2-clorophenyl)- 1,4-dihydro-6-methylpyridin-3,5-dicarboxylat.
1.4.6.1. Tính chất
Amlodipin thuộc nhĩm dihydropyridin, cĩ pKa = 8,6; thường được dùng dưới dạng muối besilat [18].
Amlodipin besilat ở dạng bột kết tinh trắng đến trắng ngà. Tan nhẹ trong nước và 2-propanol, tan tốt trong methanol, ít tan trong ethanol [1], [18], [90].
Điểm chảy: từ 195 oC đến 204 oC.
1.4.6.2. Hoạt tính sinh học
Amlodipin thuộc nhĩm chẹn calci cĩ tác dụng ngăn cản sự di chuyển của Ca2+
qua kênh nội bào. Do đĩ, amlodipin làm dãn thành mạch, cơ tim và làm giảm dẫn truyền tim, giúp máu lưu thơng dễ dàng nên làm hạ huyết áp và làm giảm các cơn đau thắt ngực [2].
Trên thị trường, các chế phẩm chứa hoạt chất amlodipin phần lớn đều ở dạng hỗn hợp của đồng phân R và đồng phân S (hỗn hợp racemic). Hai dạng đồng phân tuy cấu trúc hĩa học tương tự nhau nhưng khi vào cơ thể lại cĩ tác dụng khác nhau [60], [72].
Đồng phân S-amlodipin được xem là cĩ tác dụng dãn mạch và hạ huyết áp. Biệt
N O NH2 COOCH2CH3 Cl CH3 CH3OOC 1 3 4 5 6 2 3 4 6 1 * 5 2
dược chỉ chứa S-amlodipin đã cĩ tại Việt Nam với tên Asomex. Hiện nay, Cơng ty liên doanh Stada Việt Nam đang nghiên cứu đưa ra chế phẩm viên chứa S- amlodipin.
1.4.6.3. Các cơng trình phân tích đồng phân amlodipin
- Phương pháp HPLC sử dụng pha tĩnh bất đối CHIRAL-AGP (α1-acid glucoprotein) [53].
- Phương pháp CE với kỹ thuật CZE: sử dụng tác nhân 2-hydroxypropyl-β-CD hoặc tác nhân HS-β-CD trong mơi trường đệm phosphat 2,5 hoặc CM-β-CD trong mơi trường đệm phosphat pH 3,0 [71], [99].
1.4.7. Propranolol
Hình 1.9. Cấu trúc của propranolol
Cơng thức phân tử: C16H21NO2 KLPT: 295,8. Tên khoa học: (±)-1-Isopropylamino-3-(1-naphthyloxy)propan-2-ol.
1.4.7.1. Tính chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bột màu trắng. Tan trong nước và ethanol, khĩ tan trong cloroform, thực tế khơng tan trong ether và ethyl acetat [1], [18], [90].
Hằng số phân ly pKa = 9,5.
1.4.7.2. Hoạt tính sinh học
Propranolol là thuốc tim mạch loại chẹn beta khơng chọn lọc trên tim và khơng cĩ hoạt tính giao cảm nội tại.
Tác dụng làm giảm nhu cầu oxy lúc nghỉ và lúc gắng sức do làm giảm nhịp tim, làm giảm co thắt cơ tim và giảm huyết áp [2].
O N CH3 CH3 1 2 3 * OH
Propranolol là thuốc chẹn beta khơng chọn lọc, ngăn chặn tác dụng của epinephrin trên cả hai thụ thể β1 và β2 [2]. Chỉ cĩ dạng L-propranolol là cĩ tác dụng mạnh trong khi dạng D-propanolol hầu như khơng cĩ tác dụng
1.4.7.3. Các cơng trình phân tích đồng phân propranolol
- Phân tích bằng phương pháp HPLC với pha tĩnh là cellulose Tris(3,5- dimethylphenylcarbamat) [34].
- Phương pháp CZE: sử dụng tác nhân HP-β-CD hoặc HB-β-CD hoặc HS-β-CD trong mơi trường đệm phosphat pH 2,5 [22], [28].
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Các dẫn chất của β-CD và các hỗn hợp racemic của các dược chất cĩ tính quang hoạt như: amlodipin besilat, propranolol hydroclorid, ofloxacin, ketoconazol, miconazol nitrat, promethazin hydroclorid, nefopam hydroclorid.
Bảng 2.1. Các chế phẩm sử dụng trong nghiên cứu
Tên chế phẩm Hoạt chất Hàm lượng Số lơ Nơi sản xuất
Kem bơi da
Medskin Mico Miconazol nitrat 0,2 g/10 g 091009 DHG Pharma Viên nén Nemipam Nefopam HCl 30 mg/viên 100502 Shijiangzhuang Viên nén Amlodipin Amlodipin besilat 5 mg/viên 80758 Cipla
Viên nén Floxin Ofloxacin 200 mg/viên RE8087 Unimex Viên nén APO
propranolol Propranolol HCl 40 mg/viên HN1684 Apotex Inc. Siro Phenergan Promethazin HCl 0,09 g/90 ml 120408 Sanofi-Aventis
Viên nén
Ketoconazol Ketoconazol 200 mg/viên 081108 Stada
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nguyên liệu – Dung mơi, hĩa chất – Trang thiết bị
2.2.1.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu β-cyclodextrin loại dược dụng (Jiangsu Fengyuan Biotechnology Co. China, số lơ 210672, hàm lượng 99,0%)
- Các chuẩn racemic: amlodipin besilat, propranolol hydroclorid, ofloxacin, ketoconazol, miconazol nitrat, promethazin hydroclorid, nefopam hydroclorid do Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
Bảng 2.2. Danh mục các chuẩn racemic
Hoạt chất Số lơ Hàm lượng %
(tính trên chế phẩm nguyên trạng) AML QT145 030507 99,62 KET QT050 040310 99,59 MIC QT029 031207 99,37 NEF QT206 010511 99,29 OFL QT079 041008 99,57 PRM QT108 020607 99,87 PRL QT118 010308 99,52
2.2.1.2. Dung mơi, hĩa chất
Bảng 2.3. Danh mục dung mơi, hĩa chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung mơi, hĩa chất Loại Hãng sản xuất
1,2-propylen oxyd (> 99%) (R)-(+)-1,2-propylen oxyd (> 99%) (S)-(-)-1,2-propylen oxyd (> 99%) 1,2-butylen oxyd (> 99%) Natri hydroxyd Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) Acid orthophosphoric Dimethylsulfoxyd Methanol Acetonitril 2-propanol Ethanol Acid hydrocloric Aceton Dùng cho tổng hợp Dùng cho tổng hợp Dùng cho tổng hợp Dùng cho tổng hợp Dùng cho phân tích Dùng cho phân tích Dùng cho phân tích Dùng cho phân tích Dùng cho HPLC Dùng cho HPLC Dùng cho phân tích Dùng cho phân tích Dùng cho phân tích Dùng cho phân tích Sigma – ALDRICH Sigma – ALDRICH Sigma – ALDRICH Sigma – ALDRICH Prolabo Merck Merck Merck Merck Merck Merck Merck Merck Merck
2.2.1.3. Thiết bị
Thiết bị của Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh: (các thiết bị đã
được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025)
- Máy khuấy từ cĩ bộ phận gia nhiệt IKAMAG RTC basic, điều khiển được tốc độ khuấy và nhiệt độ, que khuấy từ bọc Teflon.
- Máy đo điểm chảy tự động Büchi Melting Point B 545.
- Máy đo quang phổ hồng ngoại FT-IR Magna-IR 760 Spectrometer Nicolet. - Máy đo phổ khối LC/MS Agilent Triple Quad 6410.
- Máy đo năng suất quay cực HORIBA-SEPA 300.
- Máy điện di mao quản Hewett Packard 3DCE, đầu dị DAD.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMADZU LC 20-AD, đầu dị RI. - Cân phân tích Mettler AG-245.
- Tủ sấy chân khơng Herius. - Máy đo pH Mettler MA 235K.
- Hệ thống cất nươc khử khống Aries. - Bể siêu âm Power Sonic 410.
Thiết bị của Viện hĩa học – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam:
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC 500 MHz.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Tổng hợp dẫn chất β-CD
Tổng hợp dẫn chất 2-O-(2-hydroxypropyl)-β-CD
Sử dụng β-CD và tác nhân 1,2-propylen oxyd để tổng hợp dẫn chất 2-O-(2- hydroxypropyl)-β-CD (Sơ đồ 2.1).
Tổng hợp dẫn chất 2-O-(2-hydroxybutyl)-β-CD
Sử dụng β-CD và tác nhân 1,2-butylen oxyd để tổng hợp dẫn chất 2-O-(2- hydroxybutyl)-β-CD (Sơ đồ 2.2).
Sơ đồ 2.1. Tổng hợp dẫn chất2-O-(2-hydroxypropyl)-β-CD Sơ đồ 2.2. Tổng hợp dẫn chất2-O-(2-hydroxybutyl)-β-CD O OH HO OH O 7 + OH O OH HO O O 7 + H2O (-) (-) O OH HO O O 7 (-) + O CH3 O OH HO OCH2CHCH3 O 7 (-) O O OH HO OCH2CHCH3 O 7 (-) O + H2O O OH HO OCH2CHCH3 O 7 OH + OH(-) 7 7 7 7 7 O OH HO OH O 7 + OH O OH HO O O 7 + H2O (-) (-) O OH HO O O 7 (-) + O CH2CH3 O OH HO OCH2CHCH2CH3 O 7 (-) O O OH HO OCH2CHCH2CH3 O 7 (-) O + H2O O OH HO OCH2CHCH2CH3 O 7 OH + OH(-) 7 7 7 7 7
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp
- Tiến hành theo dõi thời điểm kết thúc phản ứng tổng hợp và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp SKLM.
Điều kiện sắc ký:
Bản mỏng silicagel F254. Hệ dung mơi khai triển:
2-propanol – nước – amoniac đậm đặc (3 : 1 : 1) (tt/tt/tt)
Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl dung dịch nguyên liệu ban đầu (nồng độ khoảng 5 mg/ml) và dung dịch sau phản ứng. Triển khai sắc ký đến khi dung mơi đi được khoảng 2/3 bản mỏng, lấy bản mỏng ra, để khơ ngồi khơng khí.
Phát hiện: phun acid sulfuric 10% (tt/tt) trong ethanol, sau đĩ sấy 110 oC trong 15 phút hoặc phát hiện bằng hơi iod bão hịa. So sánh hình dạng, màu sắc và vị trí các vết trên sắc ký đồ.
- Đo nhiệt độ nĩng chảy. - Xác định gĩc quay cực riêng. Đo dung dịch 1% trong nước (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Gĩc quay cực riêng được tính theo biểu thức:
Trong đĩ:
20: nhiệt độ đo (oC). α: gĩc quay cực đo được.
l: chiều dài ống đo của phân cực kế (dm). c: nồng độ của chất thử trong dung dịch (g/l).
Xác định cấu trúc
- Phổ IR: tiến hành ghi phổ IR với kỹ thuật dập viên KBr. - LC/MS
[ ]α 20 = α×1000
lc
Điều kiện:
Cột: Gemini C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm). Pha động: methanol – nước (7 : 3). Đầu dị: MS.
Kiểu ion hĩa: ESI. Thế phá mảnh: 50 eV. Tốc độ dịng: 0,5 ml/phút. Nhiệt độ cột: 40 oC.
Khí nitơ (nhiệt độ, tốc độ, áp suất phun hơi): 300 oC, 7 lít/phút, 30 psi. Nhiệt độ buồng đốt: 100 oC.
- Phổ NMR được đo trong dung mơi methanol (CD3-OD) và pyridin (C6D5N). Dựa vào phổ NMR để tính độ thế [18]
Độ thế trung bình (DS) chính là số nhĩm hydroxyalkyl trên mỗi phân tử β-CD và được tính bằng biểu thức:
DS = 7 x MoS
Trong đĩ MoS là độ thế phân tử được tính dựa trên tỷ lệ giữa tín hiệu từ proton của nhĩm methyl trong nhĩm hydroxyalkyl (đỉnh chuyển dịch hĩa học ở 1,2 ppm) (A1) và tín hiệu từ proton gắn nguyên tử carbon C1 (proton glycosidic) của những đơn vị đường khan nước (A2)
Hiệu suất phản ứng mlt = w x a Trong đĩ: H(%): hiệu suất phản ứng. 2 1 A 3 A MoS × = ( ) % m m % H lt tt ×100 =
mtt: khối lượng thực tế (g). mlt: khối lượng lý thuyết (g).
w : khối lượng phân tử của sản phẩm (g). a : số mol β-CD sử dụng phản ứng.
2.2.2.2. Tiêu chuẩn hĩa 2-O-(2-hydroxypropyl)-β-CD và 2-O-(2-hydroxybutyl)-β- CD
Tính chất
Dựa vào cảm quan xác định trạng thái, màu, mùi của sản phẩm. Độ tan: theo quy định chung của DĐVN IV.
Định tính
Phổ IR: tiến hành đo phổ bằng kỹ thuật dập viên KBr. Phổ NMR.
Dựa vào phổ 1H-NMR và 13C-NMR.
Độ thế (DS)
Dựa vào phổ 1H-NMR để tính độ thế trung bình (DS).
Độ trong và màu sắc: hịa tan 1,0 g chế phẩm trong 2,0 ml nước và đun nĩng. Dung dịch sau khi để nguội đến nhiệt độ phịng phải trong (DĐVN IV, phụ lục