2.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu
2.3.4. Cỏc chỉ tiờu theo dừi và đỏnh giỏ kết quả
Để đánh giá kết quả nghiên cứu, chúng tôi đã tham khảo cách đánh giá
kết quả của những công trình nghiên cứu điều trị vết th−ơng phần mềm bằng thuốc có nguồn gốc thảo d−ợc nh−: cao cỏ lào, gạc eupoline, mỡ maduxin, cao
lân-tơ-uyn... Trên cơ sở đó, xây dựng các tiêu chuẩn đánh giá kết quả điều trị bao gồm kết quả lâm sàng và cận lâm sàng [14], [22], [31].
2.3.4.1. Diễn biến toàn thân bệnh nhân
- Việc theo dừi diễn biến toàn thõn của bệnh nhõn gúp phần đỏnh giỏ tỏc dụng kháng khuẩn, tác dụng kích thích mô hạt làm liền vết th−ơng và tác dụng không mong muốn của thuốc nghiên cứu.
- Theo dừi mạch, nhiệt độ, huyết ỏp sỏng, chiều trong suốt quỏ trỡnh điều trị theo chế độ thường quy.
- Quan sát màu sắc da, niêm mạc bệnh nhân để đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn, thiếu máu...
- Theo dừi, đỏnh giỏ cỏc phản ứng của cơ thể khi đắp thuốc nh− cảm giỏc
đau, nóng, rát tại chỗ và xung quanh vết thương sau khi đắp thuốc; đánh giá
tính chất, cường độ, thời gian và số lần xuất hiện các triệu chứng trên [14], [22], [31].
2.3.4.2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn
Tác dụng kháng khuẩn tại vết thương được đánh giá thông qua các chỉ tiêu theo dõi tình trạng diễn biến tại chỗ trên lâm sàng, nh− thời gian hết mùi hôi tại vết th−ơng, thời gian rụng hoại tử sạch vết th−ơng, tình trạng vết th−ơng se khô, giảm tiết dịch, hết phù nề…
Tác dụng này còn đ−ợc đánh giá thông qua việc cấy khuẩn dịch vết thương để xem xét sự thay đổi về chủng loại và mật độ vi khuẩn tại vết thương tr−ớc và sau điều trị.
* Trên lâm sàng:
- Thời gian mất mùi hôi tại vết th−ơng:
Thời gian mất mùi hôi tại vết thương được đánh giá trước khi đắp thuốc và mỗi lần thay băng, sau khi mở băng bộc lộ toàn bộ vết th−ơng. Đánh giá mùi hôi bằng khứu giác, cách vết th−ơng 20cm. Thời gian mất mùi hôi tại vết thương được tính từ thời điểm bắt đầu điều trị đến lần thay băng không còn thấy mùi hôi tại vết th−ơng, đõy là chỉ tiờu cú tớnh chất định tớnh, nhưng cũng
cho phép đánh giá xu hướng tiến triển của tình trạng nhiễm khuẩn tại vết thương [14], [22], [31].
- Thời gian rụng hoại tử và sạch vết th−ơng:
Thời gian rụng hoại tử tại vết th−ơng đ−ợc tính bằng ngày từ thời điểm bắt đầu điều trị đến khi vết thương đạt tiêu chuẩn sạch, nền vết thương đỏ bóng, không có giả mạc, không có mụ hoại tử, mủn nát, không còn mùi hôi, có chỉ
định khâu da hoặc ghép da phủ kín vết thương.
Tiêu chuẩn này được đánh giá bằng quan sát vết thương trong quá trình thay băng, kết hợp đánh giá kết quả cấy khuẩn tại vết thương và các xét nghiệm
đánh giá quá trình hình thành mô hạt. Đây là tiêu chuẩn quan trọng, cho phép
đánh giá khá chính xác tác dụng kháng khuẩn tại vết thương.
Tiêu chuẩn đánh giá vết thương sạch:
- Sau điều trị, nền vết thương đỏ, bóng; không có dịch mủ, máu cục, dị vật, giả mạc và mô dập nát, hoại tử. Khi thay băng, chạm nỉa nhẹ vào dễ chảy máu, quan sát dưới kính phóng đại dễ dàng thấy những nhú mô hạt ở nền vết th−ơng và nhìn thấy rõ những quai mao mạch đang hình thành.
- Bờ mép vết th−ơng gọn, không nham nhở, không còn dính những mảnh hoại tử mủn nát, nhợt nhạt. Thông thường, da xung quanh vết thương đã
có hiện t−ợng biểu mô hóa và dính với tổ chức ở phía d−ới, khi bóc băng hoặc khi chạm dụng cụ thay băng vào, cảm giác đau xung quanh miệng vết th−ơng tăng lên rõ rệt.
- Khi bóc bỏ gạc cũ bộc lộ toàn bộ vết th−ơng, cách 20cm không thấy mùi hôi tại vết th−ơng.
- Kết quả cấy khuẩn tại vết thương, mật độ vi khuẩn trên 1cm2 nhỏ hơn 103, không còn trực khuẩn mủ xanh.
- Kết quả xét nghiệm mô bệnh học, siêu cấu trúc và định l−ợng hydroxyproline cho thấy mô hạt đang hình thành [14], [22], [31].
* Trên cận lâm sàng:
- Xét nghiệm máu:
- Thời điểm xét nghiệm: trước khi đắp thuốc và sau khi đắp thuốc 7 ngày, tiến hành làm xét nghiệm tại khoa Huyết học và Truyền máu/Bệnh viện Qu©n y 103.
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Số l−ợng bạch cầu, + Công thức bạch cầu,
+ Số l−ợng hồng cầu [14], [22], [31].
- Cấy khuẩn dịch vết th−ơng:
- Nhóm nghiên cứu lấy 44 mẫu ở 44 bệnh nhân, nhóm đối chứng lấy 26 mẫu ở 26 bệnh nhân.
- Lấy bệnh phẩm làm xét nghiệm ở hai thời điểm.
+ Lần 1: trước khi đắp thuốc.
+ Lần 2: sau khi đắp thuốc 7 ngày.
- Tiến hành lấy bệnh phẩm theo ph−ơng pháp Kolesnikova A.G (1986), dùng tấm plastic vô khuẩn đã cắt sẵn ở giữa một ô trống hình vuông có diện tích 1cm2 đặt lên bề mặt vết thương. Dùng tăm bông vô khuẩn lăn đều trên bề mặt vết thương tương đương diện tích ô trống đã cắt sẵn, đặt bệnh phẩm vào ống nghiệm vô khuẩn chứa 2ml nước muối sinh lý đẳng trương và gửi đi làm xét nghiệm.
- Cấy khuẩn theo phương pháp cấy trên đĩa petri để xác định chủng loại vi khuẩn, đếm số lượng tính mật độ vi khuẩn/cm2 vết thương, xét nghiệm này
đ−ợc tiến hành tại Bộ môn - Khoa Vi sinh vật/Bệnh viện Quân y 103.
Phương pháp cấy trên đĩa petri, dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:
+ Để đĩa petri lên bàn.
+ Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương pháp chung.
+ Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào.
+ Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch.
+ Cất vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp.
- Đánh giá kết quả: so sánh sự thay đổi của chủng loại và mật độ vi khuẩn/cm2 vết thương trước và sau đắp thuốc 7 ngày, mục đích để đánh giá tác dụng kháng khuẩn của thuốc nghiên cứu [14], [22], [31].
(Nguồn: chụp trong quá trình nghiên cứu)
ảnh 2.5: Lấy dịch vết thương để cấy khuẩn
ảnh 2.6: Dụng cụ lấy mẫu cấy khuẩn
(Nguồn: chụp trong quá trình nghiên cứu) 2.3.4.3. Đánh giá tác dụng kích thích hình thành mô hạt tại vết th−ơng
Hiệu quả kích thích hình thành mô hạt trên vết thương được đánh giá
thông qua những chỉ tiêu trên lâm sàng nh−:
- Đo diện tích vết thương, để đánh giá sự thay đổi diện tích vết thương ở các thời điểm trước và sau đắp thuốc.
- Tốc độ thu hẹp vết thương trung bình trong quá trình đắp thuốc.
Tác dụng này còn đ−ợc đánh giá trên các chỉ tiêu cận lâm sàng thông qua kết quả xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm lấy ở mô phần mềm hoặc mô hạt tại vết thương trước và sau đắp thuốc như:
- Xét nghiệm mô bệnh học.
- Xét nghiệm siêu cấu trúc.
- Định l−ợng hàm l−ợng hydroxyproline trong mô mềm và mô hạt.
Thông qua kết quả của các xét nghiệm này để đánh giá quá trình hình thành sợi collagen làm liền vết th−ơng [14], [22], [31].
* Trên lâm sàng:
- Tính diện tích vết th−ơng:
Tiến hành đo diện tích vết th−ơng ở vào hai thời điểm là tr−ớc khi đắp thuốc và tr−ớc khi xử lý vết th−ơng kỳ hai.
Cách tiến hành nh− sau:
+ Đặt tấm plastic vô khuẩn đ−ợc kẻ sẵn các ô vuông có diện tích 1cm2 lên bề mặt vết th−ơng.
+ Dùng bút dạ vẽ lên tấm plastic theo chu vi vết th−ơng.
+ Tiến hành đếm số ô vuông nằm trong đường kẻ trên tấm plastic và cộng lại sẽ đ−ợc diện tích vết th−ơng cần đo [14], [22], [31].
+ Đo diện tích vết thương để đánh giá sự thay đổi diện tích vết thương tr−ớc và sau điều trị.
- Tốc độ thu hẹp vết th−ơng:
Tốc độ thu hẹp diện tích vết thương được tính theo công thức:
Trong đó: V là tốc độ thu hẹp vết thương (cm2/ngày).
S1 là diện tích vết thương trước khi đắp thuốc (cm2).
S2 là diện tích vết th−ơng tr−ớc khi xử lý vết th−ơng kỳ hai (cm2).
T là thời gian từ khi đắp thuốc đến khi xử lý vết thương kỳ hai (ngày) [14], [22], [31].
Thông qua tốc độ thu hẹp diện tích vết thương để đánh giá kết quả quá
trình biểu mô hóa tại vết th−ơng.
* Trên cận lâm sàng:
- Xét nghiệm mô bệnh học:
- Số bệnh nhân ở nhóm nghiên cứu là 44, ở nhóm đối chứng là 26.
S2 - S1 T V =
- Mỗi bệnh nhân đ−ợc làm xét nghiệm 2 lần, lấy bệnh phẩm bằng dao phẫu thuật, kích th−ớc bệnh phẩm là 0,5 x 0,5cm.
Lần 1: mẫu đ−ợc lấy là mô mềm tại vết th−ơng trong quá trình cắt lọc trước khi tiến hành đắp thuốc.
Lần 2: mẫu đ−ợc lấy là mô hạt tại vết th−ơng trong quá trình chuẩn bị tr−ớc khi ghép da mỏng hoặc khâu da khép kín vết th−ơng.
- Các mẫu đ−ợc cố định trong dung dịch glutaraldehyde 2,5% trong đệm cacodylate, sau đó được cắt thành các mảnh nhỏ kích thước là 2 x 2mm, chuyển qua các dung dịch cồn ethylic có nồng độ tăng dần 50, 70, 80, 90, 95, 100% để khử n−ớc. Kết thúc quá trình này, mẫu đ−ợc chuyển vào propylen oxide, tiếp theo là propylen oxide và epon (1/1). Đổ hỗn hợp vào khuôn, đặt mặt mẫu (chân bì - biểu bì) song song với mặt cắt. Polyme hóa trong tủ ấm 370C trong 24 giờ, sau đó 600C trong 48 giờ. Cắt bán mỏng 1μm trên máy Ultramicrotome LKB4.
Đặt các lát cắt trên lam kính, nhuộm các lát cắt theo ph−ơng pháp nhuộm HE (hematoxylin - eosin).
Đọc tiêu bản trên kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại khác nhau [14], [22], [31].
Xét nghiệm đ−ợc thực hiện tại Khoa Hình thái-Viện 69/Bộ T− lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.
- Xét nghiệm siêu cấu trúc:
- Số bệnh nhân ở nhóm nghiên cứu là 44, ở nhóm đối chứng là 26.
- Mỗi bệnh nhân đ−ợc làm xét nghiệm 2 lần, lấy bệnh phẩm bằng dao phẫu thuật, kích th−ớc bệnh phẩm là 0,5 x 0,5cm.
Lần 1: mẫu đ−ợc lấy là mô mềm tại vết th−ơng trong quá trình cắt lọc trước khi tiến hành đắp thuốc.
Lần 2: mẫu đ−ợc lấy là mô hạt tại vết th−ơng trong quá trình chuẩn bị tr−ớc khi ghép da mỏng hoặc khâu da khép kín vết th−ơng.
Các mẫu đ−ợc cố định bằng dung dịch glutaraldehyde 1% trong đệm cacodylate, sau đó đ−ợc giữ lạnh ở nhiệt độ 4 - 60C và chuyển ngay tới cơ sở làm xét nghiệm.
- Nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử quét (scan electron microscopy - SEM):
Các mẫu đã cố định được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước là 2 x 2mm, cố định lần 2 bằng dung dịch acid osmic 1% trong 2 giờ, chuyển qua các dung dịch cồn ethylic có nồng độ tăng dần 50, 70, 80, 90, 95, 100% để khử nước. Tiếp theo, mẫu được chuyển qua cồn T-butyl, làm lạnh đến -40C trong tủ lạnh. Khi đã đóng đá, làm khô trên máy đông khô JFD-310 của hãng JEOL, Nhật Bản. Gắn mẫu đã làm khô trên đế soi, mạ phủ bằng vàng, soi mẫu trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) JSM-5410LV, JEOL, Nhật Bản.
- Nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy - TEM):
Các mẫu đã cố định được cắt thành các mảnh nhỏ kích thước 1 x 1 x 1mm, cố định lần 2 bằng dung dịch acid osmic 1% trong 2 giờ, sau đó chuyển qua các dung dịch cồn ethylic có nồng độ tăng dần 50, 70, 80, 90, 95, 100% để khử n−ớc. Kết thúc quá trình này, mẫu đ−ợc chuyển vào propylen oxide, tiếp theo là propylen oxide và epon (1/1). Đổ hỗn hợp vào khuôn, đặt mặt mẫu (chân bì - biểu bì) song song với mặt cắt. Polyme hóa trong tủ ấm 370C trong 24 giờ, sau
đó 600C trong 48 giờ. Cắt lát 50nm trên máy Ultramicrotome LKB4. Nhuộm với uranium acetate và citrate chì. Kiểm tra trên kính hiển vi điển tử truyền qua (TEM) JEM 1010, JEOL, Nhật Bản [14], [22], [31].
- Xét nghiệm đ−ợc thực hiện tại Khoa Hình thái-Viện 69/Bộ T− lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.
- Xét nghiệm định l−ợng hydroxyproline:
- Số bệnh nhân ở nhóm nghiên cứu là 44, ở nhóm đối chứng là 26.
- Mỗi bệnh nhân đ−ợc làm xét nghiệm 2 lần, lấy bệnh phẩm bằng dao phẫu thuật, kích th−ớc bệnh phẩm là 0,5 x 0,5cm.
Lần 1: mẫu đ−ợc lấy là mô mềm tại vết th−ơng trong quá trình cắt lọc trước khi tiến hành đắp thuốc.
Lần 2: mẫu đ−ợc lấy là mô hạt tại vết th−ơng trong quá trình chuẩn bị tr−ớc khi ghép da mỏng hoặc khâu da khép kín vết th−ơng.
Các mẫu đ−ợc cố định bằng dung dịch glutaraldehyde 1% trong đệm cacodylate, sau đó đ−ợc giữ lạnh ở nhiệt độ 4 - 60C và chuyển ngay tới cơ sở làm xét nghiệm.
- Quy trình xét nghiệm định l−ợng hydroxyproline:
+ Chuẩn bị hóa chất;
+ Chuẩn bị mẫu;
+ Thủy phân mẫu;
+ Bay hơi acid;
+ Pha hóa chất, thuốc thử;
+ Quy trình lên màu;
+ Tính toán kết quả:
Hàm l−ợng hydroxylproline/mg =
Trong đó : A là giá trị hàm l−ợng collagen đo đ−ợc trên máy đo quang.
M là khối l−ợng mẫu (mg).
- Xét nghiệm đ−ợc thực hiện tại Khoa Sinh hóa-Viện 69/Bộ T− lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh[14], [22], [31].
Những mô hình nghiên cứu tác dụng của các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược trong điều trị vết thương phần mềm đã được áp dụng từ nhiều năm nay.
Một số nghiên cứu đã thành công, nhiều bài thuốc đã khẳng định đ−ợc tác dụng
điều trị vết thương phần mềm và vết bỏng, hiện đã và đang được ứng dụng phổ biến ở nhiều cơ sở y học có uy tín.
Để nghiên cứu tác dụng điều trị vết th−ơng phần mềm của cao lỏng bạch
đàn, chúng tôi đã áp dụng mô hình nghiên cứu mà nhiều tác giả đã thực hiện,
đó là mô hình nghiên cứu tiến cứu có so sánh đối chứng.
A x 4 M (mg)
Để đánh giá kết quả nghiên cứu, ngoài các tiêu chuẩn lâm sàng, còn có những xét nghiệm cận lâm sàng có độ tin cậy cao, đó là các xét nghiệm vi sinh vật, xét nghiệm siêu cấu trúc, xét nghiệm định l−ợng hydroxyproline. Các xét nghiệm này cho phép đánh giá khách quan, khoa học tác dụng kháng khuẩn và tác dụng kích thích mô hạt phát triển làm liền vết th−ơng.
ảnh 2.7: Một số dụng cụ thay băng, đắp thuốc
(Nguồn: chụp trong quá trình nghiên cứu)
ảnh 2.8: Thay băng, đắp gạc tẩm cao lỏng bạch đàn lên vết thương (Nguồn: chụp trong quá trình nghiên cứu)
ảnh 2.9: Phủ bên ngoài một lớp gạc vô khuẩn tr−ớc khi băng kín vết th−ơng (Nguồn: chụp trong quá trình nghiên cứu)