3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.4Phương pháp nghiên cứu những biến ựổi bệnh lý
* Chẩn ựoán xác ựịnh lợn mắc Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản bằng hai phương pháp:
- Căn cứ vào kết quả chẩn ựoán dương tắnh với virus PRRS bằng phương pháp PCR
- Dựa vào các phương pháp chẩn ựoán lâm sàng thường quy và mổ khám bệnh tắch (Hồ Văn Nam, 1982), (Hồ Văn Nam và cs, 1996) và (Chu đức Thắng và cs, 2008).
* Các chỉ tiêu sinh lý và triệu chứng lâm sàng ựược xác ựịnh bằng các phương pháp khám lâm sàng thường quy:
- Xác ựịnh tần số hô hấp thông qua việc quan sát sự hoạt ựộng của thành ngực, thành bụng và dùng ống nghe ựếm trực tiếp số lần hoạt ựộng của phổi.
- Xác ựịnh tần số tim mạch bằng phương pháp sử dụng ống nghe nghe trực tiếp hoạt ựộng của tim.
- Xác ựịnh thân nhiệt lợn bệnh bằng cách ựo trực tiếp ở trực tràng vào sáng sớm.
* Mổ khám kiểm tra bệnh tắch ựại thể và lấy mẫu gửi kiểm tra bệnh tắch vi thể các trường hợp lợn bệnh chết bằng phương pháp thường quy.
Phương pháp mổ khám lợn
Chuẩn bị mổ khám.
- Bộ ựồ mổ gia súc ựã ựược vô trùng
- Các trang thiết bị bảo hộ cho cán bộ mổ khám (Quần áo bảo hộ, găng tay, ủng, kắnh, khẩu trangẦ)
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 31
- Hoá chất: Cồn Metanon (Methanol), cồn Etanon (Ethanol) 960, focmandehyt
(Formaldehyde), glyxerin (Glycerine), natri xitrat (Natri citrat), magiê sunfat (Magesium sulfate).
Tiến hành mổ khám:
- Nếu con vật còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến ựổi lớn về mức ựộ quan sát bệnh tắch (dùng ựiện, chọc tiết, thuốc gây mê...).
- Cán bộ tham gia mổ khám phải mang ựầy ựủ các trang thiết bị bảo hộ ựã ựược chuẩn bị trước.
- Trường hợp các ca bệnh nghi có thể lây sang người tuyệt ựối không ựược mổ khám.
Kiểm tra bên ngoài: Thể trạng, da, lông, các khối u, các lỗ tự nhiên, các khớp, ngoại ký sinh trùng và các tổn thương khác.
Mổ khám kiểm tra bên trong:
đặt lợn nằm trên bàn mổ dùng dao cắt các cơ trong nách tới khớp xương bả vai, cắt các cơ trong bẹn tới khớp hông ở cả hai bên chân. Bẻ gập chân sang hai bên cho lợn nằm ngửa trên bàn.
Dùng dao rạch lớp da và cơ từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiếp lớp sụn xương ức ở hai bên lật xương ức, kéo dài tới cơ hai bên thành bụng ựể bộc lộ toàn bộ các tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng.
Quan sát những biến ựổi bên ngoài các tổ chức về màu sắc, kắch thước, hình dáng, các biến ựổi bất thường.
Lấy máu tim và các tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm.
Dùng dao cắt các cơ hai bên cằm giữ lưỡi, kéo lưỡi ra khỏi xoang miệng, kiểm tra xoang miệng.
Cắt tách lưỡi, thực quản, khắ quản, phổi, cuối cùng cắt ựứt thực quản, mạch quản giáp với cơ hoành (trước khi cắt thực quản dùng dây buộc chặt phắa dưới tránh thức ăn trào ra từ phắa dạ dày). Kéo toàn bộ hệ thống dạ dày
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 32
ruột ra ngoài kiểm tra sau cùng tránh gây nhiễm bẩn. Lấy các tổ chức trong cổ, ngực rửa nước sạch trước khi kiểm tra chi tiết bên ngoài.
Kiểm tra màng, dịch xoang bao tim, mở kiểm tra cơ, van, chân cầu bên trong tim.
Kiểm tra hạch amidan, rạch thanh quản, khắ quản, phế quản, phế nang phổi kiểm tra bên trong về màu sắc và ựộ ựàn hồi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rạch kiểm tra bên trong thực quản.
Lấy gan, mật, lá lách ra ựể kiểm tra về màu sắc, kắch thước, ựộ cứng mềm, ký sinh trùng và các tổn thương khác.
Kiểm tra tuyến tuỵ.
Cắt ựứt da, cơ dọc theo khớp bán ựộng háng, dùng mũi dao tách rời khớp bán ựộng háng, bộc lộ xoang chậu.
Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng, dạ con ở con cái, dịch hoàn, ống dẫn tinh ở con ựực) cả bên ngoài và bên trong.
Tách vỏ thận, kiểm tra bên ngoài và bổ ựôi kiểm tra bên trong thận, ống dẫn niệu, bóng ựái kiểm tra về màu sắc kắch thước, chất chứa bên trong.
Kiểm tra hệ thống hạch lâm ba trong cơ thể về màu sắc, kắch thước và ựộ ựàn hồi.
Rạch kiểm tra bên trong hệ thống tiêu hoá theo thứ tự từ dạ dày tới hậu môn loại bỏ chất chứa quan sát bề mặt niêm mạc ựặc biệt chú ý tới vùng van hồi manh tràng về các chất chứa, dịch, màu sắc, ựiểm hoại tử, xuất huyết.
Cắt kiểm tra dịch khớp, mặt khớp, màu sắc các khớp xương, chẻ dọc kiểm tra tuỷ xương bên trong.
Cắt ựầu lợn ở ựốt sống Atlas, lột da, dùng ựục hoặc cưa cắt từ lỗ chẩm sang hai bên ựến cạnh trước xương trán, lật xương hộp sọ, bộc lộ não. Dùng kéo cong vô trùng tách màng não, cắt ựứt các dây thần kinh lấy não. Tuyến yên cũng ựược kiểm tra.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 33
Dùng cưa cắt ngang xương mũi ựể kiểm tra xoang và các ống cuộn. Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu ựể xét nghiệm trong phòng thắ nghiệm. Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm.
Xử lý hấp tiêu ựộc xác hoặc thiêu ựốt, chôn lấp xử lý vôi bột.
- Các mẫu ựồng thời cũng ựược cố ựịnh trong formalin 10% ựể làm xét nghiệm bệnh tắch vi thể.
* Cùng với việc mổ khám kiểm tra bệnh tắch ựại thể, mẫu phổi lợn bệnh sẽ ựược lấy và bảo quản ựể làm tiêu bản kiểm tra bệnh tắch vi thể.
Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển
Trường hợp tiến hành mổ khám tại thực ựịa, nơi có ổ dịch, chọn các con chết ựiển hình, lấy các cơ quan phủ tạng (lách, hạch, thận, phổi) bảo quản trong ựiều kiện lạnh cho xét nghiệm virus; đồng thời lấy tất cả các cơ quan tổ chức trong cơ thể, mỗi loại cắt dày không quá 0,5 cm bảo quản trong dung dịch formalin 10% theo tỷ lệ 1 phần bệnh phẩm + 9 phần formalin cho làm xét nghiệm bệnh tắch vi thể.
đối với các mẫu máu lấy yêu cầu bảo quản có chất chông ựông (EDTA) ựể làm xét nghiệm virus huyết; Hoặc lấy các mẫu máu ựể ựông, chắt lấy huyết thanh cho làm xét nghiệm phát hiện kháng nguyên, kháng thể.
Tất cả các mẫu vật cần ựược gửi nhanh ựến phòng thắ nghiệm và ựược bảo quản theo yêu cầu kỹ thuật, có báo cáo diễn biến tình hình và biên bản mổ khám, lấy mẫu kèm theo.
đối với mẫu bệnh phẩm nguyên con (lợn choai, lợn con sau cai sữa, thai chết) nghi mắc bệnh có thể gửi nguyên con mới chết hoặc sắp chết (gửi càng nhanh càng tốt). Hoặc ựiều kiện có thể mổ khám ựược thì cần lấy các cơ quan phủ tạng (lách, hạch, thận, phổi) bảo quản trong phắch ựá có ựá lạnh gửi nhanh về phòng thắ nghiệm cho xét nghiệm virus; đồng thời lấy tất cả các cơ quan tổ chức trong cơ thể, mỗi loại cắt dày không quá 0,5 cm bảo quản trong
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 34
dung dịch formalin 10% theo tỷ lệ 1 phần bệnh phẩm + 9 phần formalin cho làm xét nghiệm bệnh tắch vi thể.
đối với mẫu bệnh phẩm máu có chất chống ựông (EDTA) và mẫu huyết thanh ựã chắt ra khỏi máu ựông, bảo quản trong phắch ựá có ựá lạnh gửi nhanh ựến phòng xét nghiệm cho xét nghiệm virus huyết hoặc phát hiện kháng nguyên, kháng thể.
(Các phương pháp mổ khám, lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu gửi ựi xét nghiệm ựược áp dụng theo tiêu chuẩn OIE và Tài liệu Tiêu chuẩn ngành Ờ Cục Thú y).
Phương pháp làm tiêu bản xét nghiệm bệnh tắch vi thể
Các mẫu phủ tạng cắt mỏng 0,5cm (nhỏ ựể nguyên) ngâm trong dung dịch formalin 10% trong 24 giờ.
Lấy các miếng tổ chức cố ựịnh trong formalin ra cắt mỏng 2 - 3mm, rửa dưới vòi nước chảy trong 2 Ờ 3 giờ.
Chuyển sang ngâm trong cồn 700 thời gian 2 Ờ 3 giờ.
Ngâm sang cồn 900 trong 2 Ờ 3 giờ.
Ngâm sang cồn tuyệt ựối 2 Ờ 3 giờ. Ngâm sang xylen 1 ựể trong 2 Ờ 3 giờ. Ngâm sang xylen 2 ựể trong 2 Ờ 3 giờ. Ngâm tẩm nến 3 lần, mỗi lần 2 Ờ 3 giờ. đúc khuôn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cắt tiêu bản:
Cắt gọt khối block nến vuông, mặt cắt bằng phẳng, ựể trên mặt khay ựá lạnh khoảng 5 Ờ 10 phút.
đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt 3 Ờ 5 ộm.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 35
Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi chưng cất nhiệt ựộ nước 30 -
350C; Dùng lam kắnh chọn lát cắt giãn phẳng, không nhăn nheo vớt, dựng
nghiêng, ựể vào tủ ấm 370C cho khô.
Nhuộm tiêu bản H&E:
để các tiêu bản vào tủ ấm 600C trong vòng 30 phút cho nến tan chảy.
Lấy ra tẩy nến trong xylen 3 lần, mỗi lần 3 Ờ 5 phút. Ngâm trong cồn tyuyệt ựối 3 Ờ 5 phút.
Ngâm sang cồn 900 ựể 3 Ờ 5 phút.
Ngâm sang cồn 700 ựể 3 Ờ 5 phút.
Rửa dưới vòi nước chảy 3 Ờ 5 phút.
Ngâm trong thuốc nhuộm Haematoxylin 1 Ờ 2 phút. Rửa dưới vòi chảy 3 Ờ 5 phút.
Ngâm trong thuốc nhuộm Eosin 60 Ờ 90 giây.
Rửa dưới vòi nước chảy 2 Ờ 3 phút, chú ý màu Eosin.
để khô trong nhiệt ựộ phòng (hoặc ngâm trong cồn 900 và cồn tuyệt
ựối), chuyển sang xylen 2 lần (mỗi lần 2 Ờ 3 phút), gắn lamen bằng Balm canada. để khô, soi kắnh.
Soi kiểm tra dưới kắnh hiển vi quang học: Từ vật kắnh có ựộ phóng ựại thấp ựến vật kắnh có ựộ phóng ựại cao.