3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.4.Giám ựịnh virus gây PRRS bằng phương pháp RT Ờ PCR (Quy trình
chẩn ựoán PRRS, Trung tâm chẩn ựoán thú y TW, 2008)
Phạm vi áp dụng: Quy trình ựược áp dụng ựể xét nghiệm phát hiện PRRSV tại các phòng xét nghiệm chẩn ựoán bệnh ựộng vật thuộc Cục Thú y.
Bệnh phẩm: huyễn dịch bệnh phẩm, huyết thanh hoặc dịch nổi tế bào sau khi phân lập virus.
Máy móc và nguyên liệu: - Hệ thống chiết tách ARN - Máy Realtime PCR - Bộ Micropipet các cỡ
- Kit chiết tách ARN(Qiagen hoặc Ambion Magmax)
- Kit RT Ờ PCR: Qiagen one step RT Ờ PCR kit (Cat No. 210210) hoặc Invitrogen supercript III qRT Ờ PCR kit(Cat No. 210210).
- Primer và probe
Cách tiến hành
- Chiết tách ARN: áp dụng theo quy trình của nhà sản xuất + Chuẩn bị master mix
Qiagen one step RT Ờ PCR kit Invitrogen SS3 qRT Ờ PCR kit
Reagent Lượng(ộl) Reagent Lượng(ộl)
DW 10.5 DW 4.5
5 x Reaction Mix 5.0 5 x Reaction Mix 12.5
MgCl2(25mM) 1.2 MgCl2(25mM) 1.0
dNTP 0.8
PPP 1.5 PPP 1.5
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 35
- Cho 20 ộl master mix vào ống PCR - Cho 5 ộl mẫu ARN vào ống PCR - đặt ống PCR vào máy Realtime PCR - Chạy chương trình
- Chọn ựọc màu ở bước kéo dài + Chạy phản ứng.
Qiagen one step Reagent Invitrogen SS3 Reagent
RT PCR RT PCR
500C Ờ 30m 500C Ờ 30m
40 x (950C Ờ 10s + 600C Ờ 50s) 40 x (950C Ờ 10s + 600C Ờ 50s)
950C Ờ 15m 950C Ờ 2m
đọc kết quả:
Xét nghiệm ựược công nhận khi:
- đối chứng dương tắnh cho giá trị Ct ựã biết (ổ2) - đối chứng âm tắnh không có Ct
- Mẫu ựược coi là dương tắnh khi có Ct ≤ 35 - Mẫu ựược coi là âm tắnh nếu không có Ct - Mẫu ựược coi là nghi ngờ nếu Ct ≥ 35
Danh mục và trình tự primer và probe
Modification Tên Primer/probe Sequence(5Ơ- 3Ơ)
5Ơ 3Ơ Probe TGT GGT GAA TGG CAC TGA TTG ACA FAM BHQ1 PRRS - 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(NA) Forward ATG ATG RGC TGG CAT TCT None None Reverse ACA CGG TGG CCC TAA TTG None None Probe CCT CTG CTT GCA ATC GAT CCA GAC FAM BHQ1 PRRS - 2
(EU) Forward GCA CCA CCT CAC CCA GAC None None Reverse CAG TTC CTG CGC CTT GAT None None Probe CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA FAM BHQ1 Forward CCCAAGCTGATGACACCTTTG None None PRRS -
China
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 36
Phương pháp xử lý số liệu
- Sau khi thu thập số liệu, tổng hợp sơ bộ ựược xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học thông qua phần mềm Excel trên máy vi tắnh với các tham số và công thức sau:
Các tham số thống kê sử dụng ựể xử lý số liệu - Số trung bình: X = n 1 ∑ = n i X 1 - độ lệch tiêu chuẩn: Nếu n ≤ 30 → Sx = ổ 1 ) ( 1 2 2 − − ∑ ∑ n X n X Nếu n > 30 → Sx = ổ n X n X ∑ 2−1(∑ )2
- Sai số của số trung bình: Nếu n ≤ 30 → 1 − ổ = n s m x x Nếu n > 30 → n s m x x =ổ Trong ựó: X : số trung bình
xi: giá trị của các biến số (i = 1, 2, 3, Ầ, n) n: dung lượng mẫu
sx: ựộ lệch tiêu chuẩn
x
m : sai số của số trung bình
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ... 37