3. Vật liệu và phương phỏ p nghiờn cứ u
3.5.Phương phỏp nghiờn cứu
3.5.1 Phương phỏp nghiờn cứu ngoài ủồng.
Lựa chọn vựng sản xuất rau tập trung ở hai huyện An Lóo, huyện An Dương – thành phố Hải Phũng chọn ngẫu nhiờn một số ruộng ủại diện ủể tiến hành ủiều tra theo dừi cỏc chỉ tiờu. ðiều tra ủịnh kỳ 7 ngày/lần, theo 5 ủiểm chộo gúc, mỗi ủiểm lấy 10 cõy.
3.5.1.1. Phương phỏp ủiều tra bệnh hại lỏ cõy cải bắp
- ðếm số lỏ bị bệnh và phõn cấp cõy bị bệnh theo thang 5 cấp như sau: + Cấp 0 : 0% diện tớch của cõy (lỏ) bị bệnh. + Cấp 1: > 0- 1% diện tớch của cõy (lỏ) bị bệnh. + Cấp 2: >1-5% diện tớch của cõy (lỏ) bị bệnh. + Cấp 3: > 5% - 25% diện tớch của cõy (lỏ) bị bệnh. + Cấp 4: > 25% - 50% diện tớch của cõy (lỏ) bị bệnh. + Cấp 5: > 50% diện tớch của cõy (lỏ) bị bệnh.
3.5.1.2. Phương phỏp ủiều tra bệnh hại thõn, rễ cõy cải bắp
- Chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ bệnh (%)
3.5.2. Phương phỏp nghiờn cứu trong phũng.
Phõn lập, nuụi cấy, giỏm ủịnh nguyờn nhõn gõy bệnh hại theo tài liệu của Mathur và Olga (1999).
3.5.2.1. Cỏc mụi trường nuụi cấy
Trong quỏ trỡnh nghiờn cứu chỳng tụi ủó sử dụng cỏc loại mụi trường: PGA, PCA, CMA, WA.
• • •
• Mụi trường PGA:
- Thành phần Khoai tõy 250g, glucose 20g, Agar 20g, nước cất 1000ml.
- Cỏch ủiều chế : Cõn 250g khoai tõy ủó rửa sạch, thỏi nhỏ cho vào nồi, thờm 1000ml nước cất ủun sụi. Sau khi nấu sụi ủược 30 phỳt thỡ lọc lấy hết phần nước chiết, bổ sung thờm nước cất cho ủủ 1000ml. Cho từ từ 20g ủường glucose và 20g agar vào dung dịch nước trờn. Mụi trường ủược cho vào cỏc bỡnh thuỷ tinh sau ủú ủem hấp khử trựng ở 1210C tại 1,5atm trong thời gian 30 phỳt. Sau ủú ủể mụi trường nguội khoảng 550C ủưa vào buồng cấy ủể ủổ
vào cỏc ủĩa petri ủó sấy khử trựng.
• • •
• Mụi trường PCA:
- Thành phần : khoai tõy 20g, cà rốt 20g, Agar 20g, nước cất 1000ml.
• • •
• Mụi trường WA: Thành phần Agar 20g, nước cất 1000ml.
- Cỏch ủiều chế: Cho ủủ lượng nước cất vào nồi, ủun ủến gần sụi thỡ cho Agar
vào khuấy ủều cho ủến khi sụi. Sau ủú ủem hấp khử trựng ở 1210C (1,5atm) trong
vũng 45 phỳt. ðể nguội 55 – 600C trước khi rút vào ủĩa petri
• Mụi trường CMA: Thành phần 30g bột ngụ, 17g agar, 1000ml nước cất Cỏch nấu : trương tự như mụi trường PGA
3.5.2.2. Phương phỏp phõn lập mẫu bệnh.
• • •
Lấy mẫu lỏ, thõn, rễ bệnh mới, ủiển hỡnh cho bệnh cần nghiờn cứu. Sau khi lấy mẫu cho vào tỳi nilon cú lút giấy thấm ẩm, ủem về phũng phõn lập luụn hoặc bảo quản ở nhiệt ủộ 40C trong tủ lạnh.
• Cỏc bước cơ bản phõn lập nấm bệnh từ lỏ hoặc thõn:
- Rửa mẫu lỏ hoặc thõn trong nước ủể loại bỏủất bụi và cỏc tạp chất khỏc. Sau khi rửa cắt những mẫu bệnh dài 1-3cm, gồm cả mụ bệnh và mụ khoẻ.
- Lau sạch bàn làm việc bằng cồn etylen 70%.
- Nhỳng panh và dao mổ trong cồn etylen 70% và hơ trờn ngọn lửa ủốn cồn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhỳng nhanh mẫu lỏ hoặc thõn vào cồn etylen 70% , rửa lại trong nước vụ trựng và ủể khụ trờn giấy thấm vụ trựng.
- Dựng dụng cụ ủó khử trựng cắt những vết bệnh nhỏ (2 x 2mm) từ
phần ranh giới giữa mụ khỏe và mụ bệnh, sau ủú cấy lờn mụi trường WA (5 miếng một ủĩa 90cm) ủặt những miếng cấy gần mộp ủĩa.
- ðặt ủĩa cấy ở 250C trong ủiều kiện ỏnh sỏng.
- Khi nấm phỏt triển cỏch miếng mụ bệnh từ 1-2cm, dựng qua cấy ủó khử trựng cắt phần ủỉnh sinh trưởng cấy truyền sang mụi trường PGA ủể tiến hành giỏm ủịnh.
3.5.2.3. Phương phỏp giỏm ủịnh.
Quan sỏt nấm dưới kớnh hiển vi, chụp ảnh và ủo kớch thước sợi nấm, bào tử nấm, hạch nấm. Quan sỏt màu sắc bào tử, hạch nấm, tản nấm trờn mụi trường (PGA). Từủú tra tài liệu giỏm ủịnh ủể xỏc ủịnh loài nấm ủang nghiờn cứu.
3.5.2.4. Nghiờn cứu một số ủặc ủiểm sinh học của nấm Alternaria
brassicae, A. brassicicola, Sclerotinia sclerotiorum
* Ảnh hưởng của mụi trường ủến sự phỏt triển tản nấm Alternaria
brassicae, A. brassicicola, S. sclerotiorum.
cú 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là một ủĩa petri. Theo dừi ủường kớnh tản nấm sinh trưởng, mật ủộ bào tử sau 3, 5, 7, 9 ngày (nấm A. brassicae), sau 2, 4, 6, 8 ngày (nấm A. brassicicola), sau 2,4,6 ngày (S. sclerotiorum).
* Ảnh hưởng của mụi trường ủến sự hỡnh thành bào tử (mật ủộ bào tử) nấm Alternaria brassicae, A. brassicicola,
- ðo mật ủộ bào tử sau 3, 5, 7, 9 ngày (nấm A. Brassicae), sau 4, 6, 8 ngày (nấm A. Brassicicola).
- Phương phỏp ủo mật ủộ bào tử: ðo bằng buồng ủếm
+ Ứng với mỗi ngày ủo mật ủộ của 1 nấm lấy 4 ủĩa ủại diện cho 4 mụi trường tương ứng.
+ Với mỗi ủĩa cắt ẳ tản nấm cho vào 1 lọ penicilin cú 10 ml nước vụ trựng tương ứng, lắc ủều ta ủược dung dịch bào tử.
+ Dựng pipet hỳt 1ml dd bào tử trong lọ vừa pha nhỏ vào buồng ủếm,
ủậy lamen, sau ủú dựng pipet hỳt hết phần dung dịch thừa. + ðưa buồng ủếm soi dưới kớnh hiển vi.
+ ðếm mật ủộ bào tử trong 30 ụ nhỏ.
* Ảnh hưởng của mụi trường ủến sự hỡnh thành hạch nấm
S.sclerotiorum
ðếm bằng mắt thường số hạch của 3 lần nhắc lại, mỗi lần là 1 ủĩa petri trờn một mụi trường.
* Ảnh hưởng của thuốc hoỏ học ủến sự phỏt triển của tản nấm
Alternaria brassicae và Alternaria brassicicola
- Thớ nghiệm với cỏc cụng thức: + Score 250EC
+ Penncozeb 80WP + Ricide 72WP - Cỏch tiến hành:
+ Cõn thuốc giảm 10 lần so với nồng ủộ khuyến cỏo.
• Score 250EC: 0.012%
• Penncozeb 80WP: 0.02% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• Ricide 72WP: 0.03%
+ Ảnh hưởng của thuốc ủến sự phỏt triển của tản nấm : Nếu nồng ủộ
thuốc bột là 0.01% thỡ 0.01g thuốc pha trong 100ml mụi trường. Nếu nồng ủộ
dung dịch thuốc là 0.01% thỡ 0.01àl thuốc pha trong 100ml mụi trường Dựng cốc ủong ủó hấp khử trựng, dựng pipet chuẩn ủể hỳt lượng thuốc cần dựng hoặc cho lượng thuốc ủó cõn sẵn vào cốc trước. Nấu và hấp khử trựng mụi trường PGA, sau ủú nguội ủến nhiệt ủộ 550C, lấy 100ml mụi trường cho vào cốc ủó cú thuốc cần dựng. Dựng ủũa thuỷ tinh khuấy cho dung dịch thuốc tan trong mụi trướng rồi ủổ ra ủĩa petri 5ml, mỗi cụng thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại là một ủĩa petri. Cụng thức ủối chứng 3 ủĩa petri khụng cú thuốc. ðo
ủường kớnh tản nấm 3,5,7 ngày sau khi cấy.
3.5.2.5. Nghiờn cứu ảnh hưởng của chế phấm nấm ủối khỏng
Trichoderma hazianum , chất kớch khỏng Bion ủến sự phỏt triển của nấm gõy
bệnh lở cổ rễ, ủốm vũng và thối hạch trờn cõy cải bắp.
* Thớ nghiệm ủược bố trớ ngẫu nhiờn với 3 lần nhắc lại tại xó Tõn Dõn - huyện An Lóo - Hải Phũng gồm 4 cụng thức, mỗi cụng thức là 1 ụ cú diện
tớch 30m2 cú dải bảo vệ xung quanh. Tổng diện tớch làm thớ nghiệm là 420m2. - Cụng thức 1: 4kg chế phẩm /sào ủ với 400kg phõn chuồng trước khi
bún lút.
- Cụng thức 2: 4kg chế phẩm /sào ủ với phõn chuồng trước khi bún lút kết hợp với phun chất kớch khỏng Bion.
- Cụng thức 3:Tưới chế phấm 4kg/sào kết hợp với phun chất kớch khỏng Bion (100g/ha).
Cỏch tiến hành : Trộn 4kg chế phẩm nấm ủối khỏng Trichoderma
hazianum với 400 kg phõn chuồng hoai mục ủể 10-15 ngày sau ủú bún vào
hốc cho một sào Bắc bộ, lấp ủất nhẹ rồi trồng cõy. Khụng sử dụng cỏc thuốc trừ bệnh khỏc.
Phũng trừ theo nụng ủược tiến hành như sau: Sau khi trồng 5-10 ngày tiến hành nhổ bỏ cỏc cõy bị bệnh, dặm tỉa vào cỏc chỗ bị khuyết nhằm ủảm
bảo mật ủộ. Thường xuyờn ngắt tỉa cỏc lỏ bị già, lỏ bệnh.
3.5.2.6 Chỉ tiờu theo dừi
- Năng suất thực thu (tấn/ha) - Màu sắc, hành dỏng bắp. - ðộ chặt của bắp
- Chiều cao cõy(cm)
- Tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh (%). - Số lỏ trờn cõy - Khối lượng bắp (kg) - Mật ủộ bào tử (bt/ml) - ðường kớnh tản nấm (mm) - Hiệu lực thuốc hoỏ học (%) - Hiệu quả phũng trừ (%) 3.6. Phương phỏp tớnh toỏn và xử lý số liệu 3.6.1. Cỏc cụng thức tớnh toỏn * Cụng thức tớnh tỷ lệ bệnh: Tỷ lệ bệnh (%) = (A/B).100 Trong ủú: A- số lỏ bị bệnh B - tổng số lỏ ủiều tra. * Cụng thức tớnh chỉ số bệnh: Chỉ số bệnh (%) =( ∑(a.b)/N.T)x100
Trong ủú : a- số lỏ bị bệnh ở mỗi cấp.
b- trị số cấp bệnh của mỗi cấp tương ứng.
∑(a.b)- tổng số của cỏc tớch số axb .
N- tổng số toàn bộ lỏ ủiều tra.
T- trị số cấp bệnh cao nhất trong bảng phõn cấp bệnh ủó dựng.
*Độ chặt của bắp đ−ợc tính theo công thức
P = G/(h1 x h2 x h3 x 0,52).
Trong đó: P - độ chặt của bắp, P<1 bắp rất chặt, P>1 bắp rất xốp. G - khối l−ợng trung bình bắp tính bằng gam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
h1,h2,h3 - đ−ờng kính 3 chiều tính bằng cm. 0,52 – hệ số điều chỉnh. * Cụng thức tớnh mật ủộ bào tử bằng buồng ủếm - Cụng thức tớnh mật ủộ bào tử: N x 109 MðBT = 4 x 781 Trong ủú: MðBT: Mật ủộ bào tử (bt/ml) N: Số bào tử trung bỡnh của 30 ụ nhỏ. * Cụng thức tớnh hiệu lực của thuốc: Cụng thức Abbott: HLT(%) =∑(C - T)/ C x 100 Trong ủú: C: ðường kớnh tản nấm ở cụng thức ủối chứng T: Chỉ số bệnh hoặc ủường kớnh tản nấm ở cụng thức thớ nghiệm
* Cụng thức tớnh hiệu quả phũng trừ của nấm Trichoderma sp. theo cụng thức Abbott
3.6.2. Xử lý thống kờ
Số liệu ủược xử lý thống kờ theo phương phỏp thống kờ sinh học IRRISTAT và EXCEL. B-N HQPT (%) = N x100% Trong ủú: HQPT: Hiệu quả phũng trừ
B: Số cõy chết ở cụng thức khụng xử lớ Trichoderma hazianum
N : Số cõy chết ở cụng thức xử lý Trichoderma hazianum sau thớ
4. Kết quả nghiờn cứu và thảo luận 4.1 Tỡnh hỡnh bệnh hại trờn cõy cải bắp tại Hải Phũng
Hải Phũng là thành phố ven biển với khớ hậu nhiệt ủới mỏt mẻ, ủộ ẩm cao do vậy thuận lợi cho phỏt triển nụng nghiệp tuy nhiờn cũng là ủiều kiện làm phỏt sinh nhiều loài bệnh nấm hại cõy trồng trong ủú ủặc biệt là cỏc bệnh nấm gõy hại cho cõy rau là khỏ phổ biến.
Cõy cải bắp là một trong những cõy rau cú hiệu quả kinh tế cao của vụ ủụng. Do vậy việc xỏc ủịnh thành phần bệnh nấm hại cải bắp và ủặc ủiểm
phỏt sinh phỏt triển của chỳng là việc cú ý nghĩa quan trọng, từ ủú giỳp xõy dựng qui trỡnh phũng trừ tổng hợp sõu bệnh hại cú hiệu quả. Chỳng tụi ủó tiến
hành nghiờn cứu ủề tài này.
4.1.1 Thành phần bệnh hại cõy cải bắp vụ ủụng 2008 và vụ xuõn 2009
Vụ ủụng và vụ xuõn là 2 vụ trồng rau chớnh của thành phố Hải Phũng.
Vụ ủụng năm 2008 diễn ra với thời tiết cú rột xen kẽ lẫn mưa nhỏ, nhiệt ủộ
trung bỡnh từ 21-270C, vụ xuõn 2009 nhiệt ủộ trung bỡnh dao ủộng từ 16-210C là ủiều kiện thuận lợi cho cõy trồng phỏt triển. Bờn cạnh ủú cũng tạo ủiều kiện cho nấm bệnh phỏt sinh, gõy hại.
Chỳng tụi tiến hành ủiều tra thành phần bệnh hại trờn cõy cải bắp tại hai huyện An Lóo và An Dương, kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Thành phần bệnh hại cõy cải bắp vụủụng 2008 và vụ xuõn 2009 tại Hải Phũng Mức ủộ phổ biến TT Tờn bệnh Tờn khoa học Bộ Vụ xuõn 2009 Vụ ủụng 2008 1 Lở cổ rễ + ++ 2 Thối nõu
Rhizoctonia solani Kuhn Mycelia Sterilia
+ + Alternaria brassicae (Berk.) Sacc ++ +++ 3 ðốm vũng Alternaria brassicicola (Schweinitz) Wiltshire Moniliales ++ ++ 4 Sưng rễ Plasmodiophora brassicae Wor Plasmodiophorales + + 5 Sương mai Peronospora brassicae Regel Peronosporales + 6 Thối hạch cải bắp Sclerotina sclerotiorum (Lib.) De Bary Pezizales +++ ++ 7 Thối ướt vi khuẩn
Erwinia carotora Bacteriales
+ +++
8 Vàng lỏ Sinh lớ +
Ghi chỳ: + Bệnh ớt phổ biến (TLB <5%)
++ Bệnh khỏ phổ biến (TLB: 5-25%)
+ ++ Bệnh phổ biến (TLB > 25%)
Qua kết quả ủiều tra cho thấy trong 2 vụ (vụ ủụng 2008 và vụ xuõn 2009) chỳng tụi ghi nhận sự xuất hiện gõy hại của 6 loại nấm, 01 loại vi khuẩn và 01 bệnh sinh lý. Trong ủú bệnh xuất hiện ở mức khỏ phổ biến ủến
phổ biến trong cả hai vụ là bệnh ủốm vũng do hai loài nấm Alternaria
brassicae, A. brassicicola và bệnh thối hạch cải bắp do nấm Sclerotina
sclerotiorum gõy ra. Bệnh thối nhũn cải bắp xuất hiện cao ở vụủụng 2008 so
với mức thấp ở vụ xuõn 2009 cú khả năng do ủiều kiện nhiệt ủộ và ẩm ủộ cao (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ở vụ ủụng 2008 phự hợp cho bệnh phỏt triển hơn là ủiều kiện nhiệt ủộ thấp ở
vụ xuõn 2009. Cỏc bệnh sưng rễ, sương mai, thối nõu ghi nhận xuất hiện ở
mức thấp. Bệnh lở cổ rễ mức ủộ xuất hiện khỏ phổ biến ở vụ ủụng 2008 so với vụ xuõn 2009.
4.1.2 ðặc ủiểm triệu chứng của một số bệnh nấm hại cõy cải bắp
Qua ủiều tra chỳng tụi khụng chỉ ghi nhận ủược sự ủa dạng về vị trớ gõy hại khỏc nhau của mỗi loại tỏc nhõn gõy bệnh mà cũn ghi nhận sự khỏc nhau về vị trớ gõy hại của cựng một loại tỏc nhõn gõy bệnh trờn cõy Cải bắp, từ cỏc vị trớ gõy hại này chỳng thể hiện cỏc triệu chứng khỏc nhau ủể phõn biệt. Vị trớ gõy hại của mỗi loại tỏc nhõn gõy bệnh ủược thể hiện ở bảng 4.2
Qua bảng 4.2 cho thấy ở giai ủoạn cõy cõy con: bắp cải chịu tấn cụng gõy hại chủ yếu của 2 loại nấm R. Solani và Plasmodiophora brassicae, ủõy là những nguyờn nhõn chớnh gõy chết rạp cõy con trờn ủồng ruộng. Nấm R.
Solani cú triệu chứng ủặc trưng nhất là rễ, cổ rễ và gốc thõn sỏt mặt ủất bị
thõm ủen sau ủú lan rộng ra rất nhanh bao quanh cổ rễ làm cho cõy khụ hộo
và ủổ gục.
Ở giai ủoạn trải lỏ bàng thấy bắt ủầu cú sự xuất hiện gõy hại của nấm sương mai Peronospora brassicae và ủặc biệt là sự gõy hại của 02 loài nấm gõy bệnh ủốm vũng Alternaria brassicae và Alternaria brassicicola trờn cỏc lỏ già và lỏ bỏnh tẻ. Cỏc loại nấm này sẽ tiếp tục gõy hại ở giai ủoạn sinh trưởng tiếp theo của cõy Cải bắp và chỳng gõy hại mạnh nếu gặp ủiều kiện thuận lợi. Vết bệnh hỡnh trũn, cú nhiều vũng ủồng tõm màu nõu xỏm (A.
Brassicae) và màu nõu ủen (A. Brassicicola), xung quanh cú thể cú quầng
vàng, nhiều vết bệnh cú thể liờn kết với nhau thành hỡnh bất ủịnh.