L ời cảm ơ n
2.1. Nội dung nghiờn cứ u
2.1.1. Nghiờn cứu quy trỡnh sản xuất chế phẩm KTLđ chống MG
- Xõy dựng quy trỡnh gõy tối miễn dịch cho gà với MG.
- Xỏc ủịnh HGKTMG trong huyết thanh của gà ủó gõy tối miễn dịch. - Xỏc ủịnh HGKTMG trong lũng ủỏ trứng của gà ủó gõy tối miễn dịch. - Xỏc ủịnh HGKTMG cú trong chế phẩm KTLđ. 2.1.2. Kiểm nghiệm một số chỉ tiờu của chế phẩm KTLđ chống MG - Vụ trựng. - An toàn. - Hiệu lực. - Thời gian bảo quản. 2.1.3. Ứng dụng thử nghiệm chế phẩm KTLđMG ủiều trị bệnh CRD cho gà 2.2. Nguyờn liệu nghiờn cứu 2.2.1. Giống vi sinh vật
- Chủng MG cường ủộc cú chứa 1x109 tế bào/ml canh trựng, do Bộ
mụn Vi trựng - Viện Thỳ y Quốc gia cung cấp.
- Vaccine MG - Bac vụ hoạt do Cụng ty Fort Dodge - Mỹ sản xuất.
2.2.2. động vật thớ nghiệm
- Gà ủẻ trứng giống ISA Brown 16 tuần tuổi. - Gà dũ 30 - 35 ngày tuổi.
- Trứng gà thu từủàn gà ủẻủó ủược gõy tối miễn dịch với MG.
2.2.3. Dụng cụ, mỏy múc
Cỏc thiết bị và cơ sở vật chất của Cụng ty Cổ Phần Phỏt triển Cụng nghệ Nụng thụn (RTD) - Hà Nội.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 31
Agar, peptone, thạch Sabouraud, thạch mỏu, nước thịt gan yếm khớẦ
2.2.5. Hoỏ chất
KH2SO4, Na2HPO4, NaCl, Chloramine B, Natri citrate, Formol...
2.2.6. Thuốc ủiều trị
- Thuốc khỏng sinh: Tylosine. - Chế phẩm KTLđMG. - Vitamin: B1, C.
2.3. Phương phỏp nghiờn cứu
2.3.1. Phương phỏp gõy tối miễn dịch cho gà ủẻ ủể tạo lượng khỏng thể MG cao trong trứng
Gà ủẻ giống ISA Brown 16 tuần tuổi trước khi làm thớ nghiệm ủược kiểm tra huyết thanh học cú kết quả õm tớnh với MG. Tiến hành chia làm 3 lụ, mỗi lụ 20 con, tiờm theo 3 quy trỡnh khỏc nhau.
* Quy trỡnh I: lụ I, tiờm cho 20 gà ủẻ với quy trỡnh như sau: - Lần 1: tiờm bắp, vaccine MG - Bac vụ hoạt liều 0,5 ml/con. - Lần 2: tiờm bắp, vaccine MG - Bac vụ hoạt liều 1 ml/con. - Lần 3: khụng tiờm.
- Lần 4: tiờm dưới da, chủng MG cường ủộc liều 0,5 ml/con. Lần 2 cỏch lần 1 là 7 ngày, lần 4 cỏch lần 1 là 28 ngày.
* Quy trỡnh II: lụ II, tiờm cho 20 gà ủẻ với quy trỡnh như sau: - Lần 1: tiờm bắp, vaccine MG - Bac vụ hoạt liều 0,5 ml/con. - Lần 2: tiờm bắp, vaccine MG - Bac vụ hoạt liều 0,5 ml/con. - Lần 3: tiờm bắp, vaccine MG - Bac vụ hoạt liều 1 ml/con . - Lần 4: tiờm dưới da, chủng MG cường ủộc liều 0,5 ml/con.
Lần 2 cỏch lần 1 là 7 ngày, lần 3 cỏch lần 1 là 14 ngày, lần 4 cỏch lần 1 là 28 ngày.
* Quy trỡnh III: lụ III, tiờm cho 20 gà ủẻ với quy trỡnh như sau: - Lần 1: tiờm bắp, vaccine MG - Bac vụ hoạt liều 0,5 ml/con. - Lần 2: tiờm bắp, vaccine MG - Bac vụ hoạt liều 1 ml/con.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 32
- Lần 3: tiờm bắp, vaccine MG - Bac vụ hoạt liều 1 ml/con. - Lần 4: tiờm dưới da, chủng MG cường ủộc liều 0,5 ml/con.
Lần 2 cỏch lần 1 là 7 ngày, lần 3 cỏch lần 1 là 14 ngày, lần 4 cỏch lần 1 là 28 ngày. Sau mỗi lần tiờm lấy ngẫu nhiờn ở mỗi lụ gà 5 mẫu huyết thanh ủể
kiểm tra HGKTMG bằng phản ứng HI.
Sau khi gõy tối miễn dịch cho cả 3 lụ gà, cứ mỗi thỏng tiến hành lấy huyết thanh và lấy trứng kiểm tra HGKTMG và xỏc ủịnh mối tương quan giữa khỏng thể trong huyết thanh gà mẹ với khỏng thể trong lũng ủỏ trứng.
2.3.2. Phương phỏp sản xuất chế phẩm KTLđMG từ lũng ủỏ trứng gà
- Thu trứng của ủàn gà ủó ủược gõy tối miễn dịch với MG ủể sản xuất. - Rửa trứng bằng Chloramin B 2%.
- Sỏt trựng vỏ trứng bằng cồn 700.
- đưa trứng vào phũng vụ trựng, thu lấy lũng ủỏ.
- Pha loóng lũng ủỏ bằng mụi trường PBS (Phosphate buffer saline) và dung mụi thớch hợp ủể tạo thành chế phẩm KTLđMG cú HGKTMG ủạt HI ≥ 5log2.
- Lọc qua màng lọc cú ủường kớnh lỗ lọc 2,5 àm.
- Kiểm tra vụ trựng, an toàn, hiệu lực của chế phẩm KTLđMG.
- Chế phẩm KTLđMG ủược ủúng trong lọ nhựa trung tớnh, vụ trựng cú dung tớch: 20 ml, 50 ml, 100 ml.
- Dỏn nhón, bảo quản 2 - 80C.
Tất cả cỏc khõu sản xuất chế phẩm ủược tiến hành trong phũng ủược khử trựng hàng ngày bằng tia tử ngoại và hàng tuần ủược xụng Formol.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 33
Quy trỡnh chế KTLđMG
Thu trứng của ủàn gà ủẻủược gõy tối miễn dịch với MG (Theo quy trỡnh III)
Rửa, sỏt trựng vỏ trứng
Mổ trứng thu lũng ủỏ
Pha với dung mụi PBS
Kiểm tra an toàn đúng chai dỏn nhón Kiểm tra HI ≥ 10log2 Kiểm tra HI ≥ 5log2 Kiểm tra vụ trựng Kiểm tra hiệu lực Bảo quản 4 - 80C
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 34
2.3.3. Phương phỏp lấy mỏu và tỏch huyết thanh
- Dựng kim tiờm vụ trựng lấy mỏu ở tĩnh mạch cỏnh của gà, mỗi con lấy 1 ml mỏu, sau ủú bơm từ từ vào ống nghiệm vụ trựng.
- để mỏu tựủụng sau ủú cho vào tủ lạnh 40C ủể huyết thanh tỏch ra. - Dựng kim tiờm vụ trựng hỳt lấy phần huyết thanh bờn trờn, ủúng vào Eppendorf, ghi nhón ủỏnh dấu từng mẫu và bảo quản -200C.
2.3.4. Phương phỏp phỏt hiện khỏng thể MG bằng phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh (Rapid plate agglutination test - RPA)
Khỏng nguyờn MG khi gặp khỏng thểủặc hiệu tương ứng sẽ kết hợp với nhau tạo thành mạng lưới ngưng kết, MG tập trung thành từng ủỏm mắt thường nhỡn thấy ủược. Phản ứng ủược thực hiện trờn phiến kớnh gồm cỏc bước sau:
- Nhỏ lờn phiến kớnh 1 giọt khỏng nguyờn MG, sau ủú nhỏ 1 giọt huyết thanh cần chẩn ủoỏn, trộn ủều.
- Làm ủối chứng õm: nhỏ lờn phiến kớnh 1 giọt khỏng nguyờn MG, sau
ủú nhỏ 1 giọt nước sinh lý, trộn ủều. - Sau khi trộn 1 phỳt ủọc kết quả:
Phản ứng dương tớnh: khỏng nguyờn MG và khỏng thể ủặc hiệu tương
ứng kết hợp với nhau tập trung thành từng ủỏm, màu xanh tớm.
Phản ứng õm tớnh: MG phõn tỏn ủều trong hỗn dịch giống bờn ủối chứng.
2.3.5. Phương phỏp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (Haemagglutination Inhibition - HI) ủể phỏt hiện khỏng thể MG
MG cú ủặc tớnh gõy ngưng kết hồng cầu gà. Phản ứng HI ủược thực hiện dựa vào khả năng kết hợp của khỏng thể MG ủối với khỏng nguyờn MG, do ủú làm mất hoạt tớnh gõy ngưng kết hồng cầu của MG.
Muốn làm phản ứng HI trước hết phải làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (phản ứng HA) mục ủớch ủể xỏc ủịnh 4 ủơn vị ngưng kết dựng trong phản ứng HI. Hai phản ứng này ủược tiến hành trờn tấm nhựa vi ngưng kết (Microtest plate) 96 lỗủỏy hỡnh chữ U dung tớch mỗi lỗ 0,1 ml kiểu Takatsi.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 35
* Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (Hemagglutination test - phản ứng HA) Phản ứng gồm cỏc bước sau:
- Pha loóng MG (pha bằng nước muối sinh lý vụ trựng) theo cỏc bậc pha loóng: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16Ầ
- Nhỏ 25 àl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả cỏc lỗ MG ủó pha loóng. - Làm ủối chứng õm: nhỏ 25 àl nước muối sinh lý, sau ủú nhỏ 25 àl hồng cầu gà 0,5%. Lắc nhẹ tấm nhựa, ủểở nhiệt ủộ phũng. Sau 20 phỳt, khi ở
lỗủối chứng õm hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn thỡ ủọc kết quả. Phản ứng dương tớnh: hồng cầu bị ngưng kết nằm rải thành mảng ởủỏy lỗ. Phản ứng õm tớnh: hồng cầu bị lắng xuống ủỏy thành cục trũn giống như lỗủối chứng õm.
Hiệu giỏ phản ứng HA: là ủộ pha loóng MG cao nhất mà ở ủú vẫn cũn hiện tượng ngưng kết hồng cầu, người ta gọi ủú là 1 ủơn vị HA.
Trong phản ứng HI người ta dựng khỏng nguyờn cú 4 ủơn vị HA. để
phản ứng HI chớnh xỏc cần phải xỏc ủịnh chớnh xỏc 4 ủơn vị HA. Xỏc ủịnh 4 ủơn vị HA:
Trờn tấm nhựa Microtest plates dựng 4 dóy, mỗi dóy 4 ụ, nhỏ vào mỗi ụ 25 àl nước muối sinh lý. Ở ụ ủầu của mỗi dóy nhỏ 25 àl khỏng nguyờn ủó pha cú 4 ủơn vị HA. Trộn ủều, chuyển 25 àl từ ụ 1 sang ụ 2, làm như vậy ủến ụ thứ 3. Sau khi trộn ủều ụ thứ 3 thỡ hỳt bỏ 25 àl. Hiệu giỏ HA của cỏc ụ là: ụ 1 cú 2 ủơn vị HA, ụ 2 cú 1 ủơn vị HA, ụ 3 cú 0,5 ủơn vị HA. Sau ủú nhỏ 25 àl hồng cầu cho mỗi ụ. ễ thứ 4 làm ủối chứng chỉ cú nước muối sinh lý và hồng cầu. Lắc nhẹ tấm nhựa, ủể 20 phỳt ở nhiệt ủộ phũng rồi ủọc kết quả. Nếu hiện tượng ngưng kết hồng cầu chỉ xảy ra ủến ụ thứ 2 là khỏng nguyờn ủó pha
ủỳng 4 ủơn vị HA.
* Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI) gồm cỏc bước sau : - Pha loóng huyết thanh ở cỏc ủộ pha loóng: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16Ầ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 36
- Lắc nhẹ, ủể khay phản ứng ở nhiệt ủộ phũng trong 30 phỳt cho khỏng nguyờn và khỏng thể (nếu cú) kết hợp với nhau.
- Làm ủối chứng:
đối chứng dương: cho 50 àl nước muối sinh lý và 50 àl hồng cầu gà 0,5%.
đối chứng õm: cho 50 àl khỏng nguyờn và 50 àl hồng cầu gà 0,5%. Sau khi ủ, cho 50 àl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả cỏc lỗ phản ứng. Lắc nhẹ, ủểở nhiệt ủộ phũng sau 20 phỳt. Khi lỗủối chứng dương, hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn thỡ ủọc kết quả.
Phản ứng dương tớnh: hồng cầu lắng xuống ủỏy thành cục trũn.
Phản ứng õm tớnh: hồng cầu bị ngưng kết nằm rải thành mảng ở ủỏy lỗ. Hiệu giỏ phản ứng HI: là ủộ pha loóng huyết thanh cao nhất mà ở ủú vẫn cú khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu.
2.3.6. Phương phỏp kiểm tra chỉ tiờu vụ trựng của chế phẩm KTLđMG
Một trong cỏc chỉ tiờu quan trọng của chế phẩm KTLđMG là vụ trựng.
để kiểm tra chỉ tiờu vụ trựng của chế phẩm, chỳng tụi dựng phương phỏp nuụi cấy vi khuẩn và nuụi cấy nấm. Cỏc lụ chế phẩm ủược nuụi cấy trờn cỏc mụi trường: nước thịt, nước thịt gan yếm khớ, thạch thường, thạch mỏu, thạch nấm Sabouraud.
Mỗi ống mụi trường ủược cấy 0,2 ml chế phẩm. để tủ ấm 370C theo dừi 24 - 48 giờ kiểm tra sự cú mặt của vi khuẩn. Trờn mụi trường thạch nấm, sau khi cấy chế phẩm, ủể ở nhiệt ủộ 280C theo dừi 5 - 7 ngày kiểm tra sự cú mặt của nấm mốc.
Chế phẩm ủạt chỉ tiờu vụ trựng khi cỏc ống mụi trường cấy chế phẩm khụng cú mặt vi khuẩn và nấm.
2.3.7. Phương phỏp kiểm tra chỉ tiờu an toàn của chế phẩm KTLđMG
để kiểm tra chỉ tiờu an toàn của chế phẩm KTLđMG chỳng tụi dựng phương phỏp thử nghiệm trờn gà.
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 37
Chọn gà 35 ngày tuổi khoẻ mạnh, khụng mắc bệnh do MG gõy ra, chưa tiờm phũng vaccine MG. Chia làm 4 lụ, tiờm dưới da chế phẩm KTLđMG với liều khỏc nhau. Sơ ủồ bố trớ thớ nghiệm như sau:
đối tượng nghiờn cứu Số lụ TN Số gà (con) Liều chế phẩm
(ml/con) đường tiờm
1 10 1 Dưới da
2 10 2 Dưới da
Gà thớ nghiệm
3 10 3 Dưới da
Gà ủối chứng 4 10 Khụng tiờm -
Sau khi tiờm chế phẩm KTLđMG tiến hành theo dừi ủàn gà. Theo dừi phản ứng cục bộ nơi tiờm trong 24 - 48 giờ và phản ứng toàn thõn trong 10 ngày. Chế phẩm an toàn khi: gà hoàn toàn khỏe mạnh, hoạt ủộng, ăn uống, ủi lại bỡnh thường, khụng cú cỏc biểu hiện triệu chứng lõm sàng, giống như gà ủối chứng.
2.3.8. Phương phỏp kiểm tra chỉ tiờu hiệu lực của chế phẩm KTLđMG
để kiểm tra hiệu lực của chế phẩm KTLđMG, chỳng tụi dựng phương phỏp cụng cường ủộc trờn gà.
Dựng 40 gà 35 ngày tuổi, gà khoẻ mạnh, chưa tiờm phũng vaccine MG, khi kiểm tra huyết thanh học õm tớnh với MG. Thớ nghiệm ủược tiến hành 2
ủợt, mỗi ủợt 20 gà và chia thành 2 lụ, mỗi lụ 10 con:
- Lụ thớ nghiệm: tiờm dưới da chế phẩm KTLđMG với liều 1 ml/con, sau 24 giờ tiờm dưới da 0,5 ml canh trựng MG cú chứa 1x109 tế bào/ml.
- Lụ ủối chứng: tiờm dưới da 0,5 ml canh trựng MG chứa 1x109 tế bào/ml. Sau khi tiờm theo dừi ủàn gà trong 21 ngày, theo dừi biểu hiện của ủàn gà, số con sống, chếtẦ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 38
2.3.9. Phương phỏp theo dừi thời gian bảo quản của chế phẩm KTLđMG
* điều kiện theo dừi:
- Nhiệt ủộ theo dừi: 4 - 80C. - độẩm tương ủối: 75 - 85%.
- Quy cỏch mẫu: mẫu ủựng trong lọ nhựa trung tớnh cú dung tớch 20 ml, 50 ml, 100 ml.
* Cỏc chỉ tiờu ủược ủỏnh giỏ theo phương phỏp dưới ủõy:
Chỉ tiờu kiểm tra
Thời gian
kiểm tra Tiờu chuẩn
Phương phỏp kiểm tra Trạng thỏi bờn ngoài 1 thỏng/lần Nhũ dịch cú màu vàng ủặc trưng, khụng vún cục Cảm quan Vụ trựng 1 thỏng/lần Khụng phỏt hiện nhiễm khuẩn nấm mốc sau 24, 48, 72 giờ Nuụi cấy trờn 5 mụi trường cơ bản An toàn 1 thỏng/lần An toàn Thử nghiệm trờn gà HGKTMG 1 thỏng/lần HI ≥ 5log2 HI
2.3.10. Phương phỏp xỏc ủịnh gà bệnh CRD dựng cho thử nghiệm ủiều trị
bằng chế phẩm KTLđMG
Xỏc ủịnh gà mắc bệnh CRD bằng phương phỏp chẩn ủoỏn lõm sàng: gà bệnh cú biểu hiện giảm ăn, chảy nước mắt, nước mũi, nước mũi lỳc ủầu loóng sau ủặc dần, con vật hỏ mỏ ra ủể thở vỡ ngạt mũi. Một số con trong ủàn hắt hơi, ho, vẩy mỏ, khũ khố, con vật vẫn cũn ăn ủược, ủụi khi viờm kết mạc mắt.
đồng thời quan sỏt những dấu hiệu khụng ủặc trưng phổ biến như giảm tốc ủộ
Trường đại học Nụng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệpẦẦẦ 39
* Bố trớ thớ nghiệm: gà mắc bệnh CRD ủược ủiều trị theo 3 phỏc ủồ sau: