Nhân giống truyền thống ở loa kèn gặp rất nhiều khó khăn chủ yếu do những trở ngại trong việc ựiều khiển ngủ nghỉ của củ và sự nhiễm bệnh. Kỹ thuật này có một số nhược ựiểm là hệ số nhân giống thấp, thường chỉ tạo củ nhỏ từ mảnh vảy củ với thời gian cảm ứng ngủ nghỉ kéo dài (2 - 3 tháng), tốc ựộ sinh trưởng chậm và chỉ giới hạn ở một số giống Lilium . [29].
- Phương pháp tách củ nhỏ
Nếu cần nhân một cây hoặc nhiều cây, có thể áp dụng phương pháp sau: Thông thường những củ già có thể mọc nhiều củ nhỏ, tháng 9 - tháng 10 thu hoạch hoa loa kèn, chỉ cần tách mấy củ nhỏ, cất trữ vào cát ựể trong
phòng qua ựông, mùa xuân năm sau ựem trồng vào chậụ Nuôi ựến tháng 9 - tháng 10 năm thứ 3 là có thể mọc củ lớn. Phương pháp này ta thu ựược lượng ắt hơn, chỉ thắch ứng với nghề trồng hoa gia ựình.
- Phương pháp giâm vảy
Phương pháp này có thể nhân ựược số lượng vừa phảị Mùa thu ựào củ lên, lấy bẹ củ già, dàỵ Mỗi bẹ cần ựể một ắt rễ, hong khô, sau ựó cắm vào chậu hoa hoặc hòm ựựng cát, ựể 2/3 gốc cắm vào thuốc BVTV, giữ cho thuốc BVTV ẩm và nhiệt ựộ khoảng 200C, sau nửa tháng sẽ mọc rễ. Nhiệt ựộ mùa ựông cần giữ ở 180C, cát không nên quá ẩm. Nuôi ựến mùa xuân năm sau, gốc củ mọc bẹ nhỏ, tách ra trồng vào chậu, tăng cường quản lý, sau 3 năm là có hoa nở. [13].
- Phương pháp tách chồi
Nhân giống bằng tách chồi cây chỉ thắch hợp cho một số loàị Phương pháp như sau: Lấy nụ chồi nách lá phắa dưới gốc ựem nuôi, chúng sẽ mọc thành củ và ra hoa, thường phải mất 2 - 4 năm. để xúc tiến hình thành các chồi nhỏ, sau khi hoa nở có thể nén ngọn cây và lấp ựất vào, hoặc lấp ựất cao vào cây có 3 - 4 lá nách, chúng có thể hình thành chồi
2.6.1.3 Nuôi cấy mô tế bào
Nhân giống vô tắnh in vitro là phương pháp nhân giống có hiệu quả nhất, vừa có hệ số nhân cao, chất lượng củ, cây giống ựồng ựều, sạch bệnh ựáp ứng nhu cầu công tác nghiên cứu và sản xuất.
Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy rất quan trọng, có ý nghĩa quyết ựịnh ựến chất lượng, số lượng củ con, củ nhỏ sau nàỵ Khi sản xuất giống hoa loa kèn vảy củ ựã trở thành nguồn vật liệu chắnh cho việc nuôi cấy mô. Robb (1957) và Allen (1974) ựã nghiên cứu và kết luận rằng nuôi cấy mô từ vảy củ cho hiệu quả tốt hơn từ các bộ phận khác của cây hoa loa kèn.
Các nghiên cứu về nhân nhanh in vitro các giống hoa loa kèn ựã ựược thực hiện thành công bởi nhiều tác giả trong và ngoài nước (Nhut,1988;
Nguyễn Quang Thạch et al., 1996; 1999; Roh, 1996; Piyadarshi, 1992; Ikeda, 2003; Lian, 2003; Lorerra, 2003; Thakur, 2006)
Năm 1968, Sheridan ựã sử dụng ựoạn thân ựể nuôi cấỵ Năm 1995, Verron và cs ựã nuôi cấy thành công ựoạn thân, chồi ựỉnh, chồi nách của giống Convallaria maalis trên môi trường cơ bản MS, ông cũng tiến hành nuôi cấy chồi hoa và ựế hoạ Cũng trong năm này Stabber. M, Ferrieria D.I ựã tái sinh ựược chồi từ hoa non. Năm 1979, Niimi & Onozwa ựã sử dụng mô lá làm vật liệu nuôi cấy khởi ựầụ Năm 1994, Wickremesinhe ẸM & Holcomb ẸJ ựã tạo ựược mô sẹo từ lá non trên môi trường cơ bản MS trong ựiều kiện tối hoặc chiếu sáng ở nhiệt ựộ 250C. [33].
T.Woznewski và CS tiến hành nuôi cấy Lilium testacium bằng vật liệu vảy củ in vitro trên môi trường MS + 0,1ppm NAA + 0,1ppm Kinetin cho hiệu quả tốt nhất. Sau 3 chu kì trong 9 tháng, 6000 cây con ựược tạo ra từ một mẫu cấy ban ựầụ
Chang Chen và cộng sự, tiến hành nhân giống L. speciosum Thunb var gloriosoides Bker bằng vảy củ in vitro trên môi trường MS + 0,1ppm NAA+ 30g/L saccaroza cho hiệu quả nhân nhanh tốt nhất Năm 1982, Taykama và Takashige cho rằng: nếu môi trường chứa 30g/l sacaroza thì ựể phá ngủ cho củ loa kèn cần xử lý nhiệt ựộ 50C trong 70 ngàỵ Nếu hàm lượng ựường lên tới 90g/l thì thời gian cần ựến 120 - 140 ngàỵ [35].
Tại nước ta, Dương Tấn Nhựt tiến hành thắ nghiệm trên vật liệu vảy củ in vitro ựã sử dụng MS +0,5ppmTDZ ựể nhân nhanh với 9 chồi/mẫu cấy hoặc MS + 0,2ppmBA cho 3 củ/mẫu cấỵ
Năm 1993, tác giả Mai Xuân Lương & cs ựã nghiên cứu thăm dò quy trình nhân giống L.longiflorum Hance trên các môi trường cơ bản khác nhau như: MS, White, B5, KnopẦ và ựưa ra kết luận môi trường MS bổ sung thêm vi lượng là tốt nhất. [10].
Năm 1996, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Phương Thảo ựã ựưa ra quy trình nhân giống loa kèn màu tắm nhập nội từ Pháp. [18].
Năm 2001, Dương Tấn Nhựt ựã ứng dụng thành công kỹ thuật cắt lát mỏng tế bào ựoạn thân vào nuôi cấy in vitro L. longiflorum. [29].
Năm 2003, Nguyễn Thái Hà nghiên cứu sự tạo củ Lilium ssp. và ựưa ra kết luận ựường saccaroza là thành phần quan trọng nhất ựến tạo củ. [6].
Dương Tấn Nhựt (2007) sử dụng môi trường MS + 0,2ppmBA ựể tạo chồi bằng phương pháp cắt ựoạn thân. Chồi từ ựoạn thân ựược nhân nhanh trên môi trường MS + 0,5ppmBA cho hiệu quả ựến 30 chồi mới/mẫu cấỵ
TS Dương Tấn Nhựt ựã ứng dụng kỹ thuật biorecater ựể sản xuất một số lượng lớn cây giống hoa lily trong thời gian ngắn. Ban ựầu, tế bào mô của củ hoa ựược nuôi cấy trong bình thuỷ tinh ựược thiết kế chuyên biệt và ựặt trên mấy lắc. Sau ba tháng nuôi cấy, tế bào mô sẽ ra rễ và tạo củ. Tiếp ựó củ sẽ ựược nuôi cấy bằng kỹ thuật bioreater. Từ một củ con ban ựầu, sau ba tháng nuôi cấy có thể tạo ra 3 - 4 củ mớị Với bình nuôi cấy có thể tắch 20 lắt, chỉ sau 1 - 2 tháng là có thể tạo ra 10.000 cây giống. Các kết quả thử nghiệm cho thấy cây con nuôi cấy bioreater có khả năng sống sót và sinh trưởng trong môi trường tự nhiên lên tới 95%.[28].
Năm 2001, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn ựã thành công trong nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống cây hoa loa kèn. [17]. Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Quang Thạch, ựã nghiên cứu ảnh hưởng của các ựiều kiện bảo quản khác nhau ựến chất lượng củ giống cũng như khả năng sinh trưởng, phát triển của chúng trên ựồng ruộng và có một số kết luận sau: Trong ựiều kiện không khắ bình thường, sự hao hụt khối lượng củ lên tới 75,8% và củ giống hoàn toàn mất sức nảy mầm sau 6 tuần bảo quản. Khi củ giống ựược giữ lại trong bình nuôi cấy, khối lựợng củ không những không giảm mà còn tăng lên 20,8%. Tuy nhiên biện pháp bảo quản này phức tạp, tốn diện tắch và dụng cụ bảo quản. Ưu ựiểm nhất là bảo quản lạnh.
Sau 6 tuần, sự hao hụt khối lượng củ chỉ là 17,9%. Tỷ lệ mộc mầm của củ ựạt 25% sau 10 ngày và 100% sau 20 ngàỵ Như vậy tác dụng củ nhiệt ựộ không chỉ làm giảm cường ựộ hô hấp, giảm sự tiêu hao chất hữu cơ mà nó còn xúc tiến quá trình mọc mầm của củ. [25].
Hàm lượng ựường saccaroza từ 3 - 6 % trong môi trường tạo củ chưa có tác dụng kéo dài thời gian ngủ nghỉ của củ giống. Sau khi trồng 19 - 21 ngày, tỷ lệ mọc mầm của các công thức ựều ựạt 100%. Tuy nhiên cây sinh trưởng, phát triển tốt hơn khi củ giống ựược tạo trong môi trường có nồng ựộ ựường saccaroza 5%.
2.6.2. Một số nghiên cứu về xử lý xuân hoá củ giống hoa loa kèn ựến sinh trưởng phát triển và ra hoa của cây hoa loa kèn. trưởng phát triển và ra hoa của cây hoa loa kèn.
Bằng xử lý xuân hoá củ giống, từ năm 1986, bộ môn sinh lý thực vật, trường đH Nông nghiệp Hà Nội ựã ựề xuất kỹ thuật sản xuất hoa loa kèn sớm. đến nay, hàng năm ựã có hàng vạn củ giống ựược xử lý và ra hoa vào Tết âm lịch và ngày quốc tế phụ nữ (8/3) góp phần làm phong phú thêm thị trường hoa tươi của Hà Nội và làm tăng thu nhập cho người trồng hoạ
Kết quả nghiên cứu của Hoàng Minh Tấn và Nguyễn Quang Thạch (1990) về việc xử lý nhiệt ựộ thấp ựể sản xuất hoa loa kèn trái vụ ựã xác ựịnh ảnh hưởng mạnh mẽ của nhiệt ựộ xuân hoá lên sự ra hoa của loa kèn trắng. Nếu muốn loa kèn ra hoa trong dịp Tết Nguyên đán thì nhiệt ựộ xử lý củ giống là 5 - 8 0C trong 15 - 20 ngày, nếu nhiệt ựộ xử lý là 10 0C thì thời gian xử lý kéo dài ựến 30 ngàyẦ đây là một tiến bộ kỹ thuật ựã ựược xử dụng khá hiệu quả cho các vùng trồng hoa ở Miền Bắc. [15].
Năm 1990, Mask. Rosh nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ựộ cao sau khi trồng ựến sự hình thành hoa của 4 giống loa kèn, củ ựược xử lý lạnh sau ựó ựem trồng ở nhiệt ựộ có biên ựộ dao ựộng từ 26 - 240C và 16 - 130C. Kết quả ở trường hợp 1 thời gian ra hoa rút ngắn, số hoa dị hình nhiều hơn so với trường hợp 2 Ông kết luận nhiệt ựộ cao sau khi trồng và trước khi hình thành
hoa ảnh hưởng xấu ựến số lượng và chất lung hoa hình thành từ củ giống ựã ựợc xử lý lạnh. [28].
Năm 1992, Nguyễn Mạnh Khải và cộng sự thắ nghiệm trên cây hoa loa kèn trắng thấy hiệu quả làm tăng chiều cao cây, số bông khi kéo dài thời gian chiếu sáng và phun GA3 nhiều lần trên loa kèn trái vụ. [11].
Năm 1994, Phạm Thị Cậy nghiên cứu về ảnh hưởng của xử lý nhiệt ựộ thấp và GA3 ựến sinh trưởng và phát triển của một số cây họ hành tỏi Liliaceaẹ Kết quả thu ựược là nhiệt ựộ thấp có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng, GA3 làm cây sinh trưởng phát triển tốt hơn. [1].
Năm 1997, Cao Ngọc Thuý và Hoàng Minh Tấn nghiên cứu về hiệu quả của việc xử lý nhiệt ựộ thấp 50C ở các thời gian khác nhaụ Kết quả việc xử lý củ giống ở thời gian 20 ngày ựã rút ngắn thời gian sinh trưởng từ 193 ngày xuống 114 ngày và thời gian nảy mầm trong 1 tháng. [15].
Năm 1998, J.Sub và J. Lee ựã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ựộ và chất lượng ựến sự hình thành củ hoa loa kèn con và cho thấy ở nhiệt ựộ 20 - 250C thì số lượng, khối lượng, ựường kắnh củ con tăng hẳn so với nhiệt ựộ 300C, số lượng củ con cũng tăng hơn dưới ánh sáng ựỏ. [18].
2.6.3 Một số nghiên cứu khác về loa kèn.
để tạo ra các giống loa kèn mới có những ựặc tắnh tốt như: kháng sâu bệnh, có hình dáng, màu sắc mới lạ từ những loài hoang dại thì cần thiết phải khắc phục ựược những rào cản trong quá trình lai khác loàị
Các kỹ thuật như thụ phấn in vitro, cứu phôi có thể khắc phục ựược hiện tượng trên. Sử dụng các kỹ thuật trên phép lai giữa các loài hoang dại với các loài và cây trồng từ các nhóm khác nhau trong chi Lilium (L.longiflorum, L. henryi, L. canadense, L. concolor, L. dauricum, L.candicum, L. rubellum, L. martagon, Asiatic và Oriental hybrids) có thể ựược tiến hành.
Ngoài phương pháp lai tạo, có thể tạo ra giống mới bằng phương pháp chuyển gen. Việc chuyển gen kháng bệnh, chủ yếu là bệnh virus cũng ựang ựược quan tâm (Pelknon, 2005). [24].
Sử dụng phương pháp này người ta ựã tạo ra giống mới có ựộ bền hoa cắt cao trên giống Asiatic hybrids (Meulen, J.J.M Van Der, J.C Van Oeveren, J.M Sandbrink & J. M Van Tuyl, 1996). [32].
TS. Nguyễn Thị Lý Anh (2006 - 2008) ựã và ựang nghiên cứu xây dựng phương pháp chuyển gen cho cây hoa ựồng tiền và hoa loa kèn bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens; Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong ựánh giá nguồn gen phục vụ công tác chọn giống loa kèn (Lilium spp.) ở Việt Nam (TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, 2006 - 2008).
Năm 2000, nhóm tác giả Yoshiji Niimi, Dong - Sheng Han, Makoto Fujisaki nghiên cứu nuôI cấy bao phấn L. enchanment thuộc nhóm Asiatic hybrids trên môi trường MS chứa 6% saccaroza, bổ sung 2mg/l picloram và 2mg/l zeatin ựã thu ựược 20 cây (chiếm 41%) sạch virus.
Phần thứ ba: VẬT LIỆU NỘI DUNGVÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. đối tượng, vật liệu, ựịa ựiểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. đối tượng
Giống: Hoa loa kèn trắng Lilium longiflorum, có chu vi từ 12-14cm Giá thể: Mùn cưa, xơ dừa, trấu hun
Thuốc BVTV: Thuốc trừ nấm Alies
3.1.2. địa ựiểm nghiên cứu
Khu thực nghiệm Viện Sinh học Nông nghiệp - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội
3.1.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 7/2009 - 10/2010
3.2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của biện pháp xử lý thuốc BVTV, thời gian trồng sau xử lý lạnh, giá thể xử lý và thời ựiểm trồng ựến kết quả xuân hoá, tình hình sinh trưởng phát triển và năng suất của cây hoa lao kèn.
Thắ nghiệm 1: Ảnh hưởng của biện pháp xử lý thuốc BVTV ựến kết quả xuân hoá, sinh trưởng phát triển và chất lượng của cây hoa lao kèn.
CT 1: Củ giống ựược trồng không qua xử lý lạnh
CT 2: đ/C (Củ giống không xử lý thuốc trước khi xử lý lạnh) CT 3: Củ giống ựược xử lý nước 15 phút trước khi xử lý lạnh CT 4: Củ giống ựược xử lý thuốc 5 phút trước khi xử lý lạnh CT 5: Củ giống ựược xử lý thuốc 10 phút trước khi xử lý lạnh CT 6: Củ giống ựược xử lý thuốc 15 phút trước khi xử lý lạnh CT 7: Củ giống ựược xử lý thuốc 20 phút trước khi xử lý lạnh
Mỗi công thức xử lý và trồng 100 củ cho 3 lần lặp lạị Củ giống ựược xử lý (ngâm) bởi thuốc trị nấm Alies với liều lượng 5g/01 lắt nước cùng thời lượng và nhiệt ựộ, chăm sóc như nhaụ Từ ựó ựánh giá ảnh hưởng của việc xử lý thuốc BVTV trước khi xử lý xuân hoá tới kết quả xuân hoá, tình hình phát triển và chất lượng hoạ
Thắ nghiệm 2: Ảnh hưởng của giá thể xử lý củ giống ựến kết quả xuân hoá, tình hình sinh trưởng, ra hoa và chất lượng hoa loa kèn.
CT 1: Củ giống ựược trồng không qua xử lý lạnh CT 2: đ/C (Củ giống ựược xử lý lạnh không giá thể CT 3: Củ giống ựược xử lý lạnh với bao có ựục lỗ CT 4: Củ giống ựược xử lý lạnh với trấu hun CT 5: Củ giống ựược xử lý lạnh với mùn cưa CT 6: Củ giống ựược xử lý lạnh với xơ dừa
CT 7: Củ giống ựược xử lý lạnh với hỗn hợp mùn cưa + xơ dừa + trấu hun Mỗi công thức xử lý và trồng 100 củ cho 3 lần lặp lạị Từ ựó ựánh giá ảnh hưởng của giá thể xử lý lạnh tới kết quả xuân hoá, tình hình sinh trưởng phát triển, ra hoa và chất lượng của cây hoa loa kèn.
Thắ nghiệm 3: Ảnh hưởng của thời gian trồng sau xử lý củ tới sinh trưởng, ra hoa và chất lượng của cây hoa lao kèn.
CT 1: Củ giống ựược trồng không qua xử lý lạnh
CT 2: đ/C (Củ giống ựược trồng ngay sau khi xử lý lạnh) CT 3: Củ giống ựược trồng sau xử lý lạnh 5 ngày
CT 4: Củ giống ựược trồng sau xử lý lạnh 10 ngày CT 5: Củ giống ựược trồng sau xử lý lạnh 15 ngày CT 6: Củ giống ựược trồng sau xử lý lạnh 20 ngày
Mỗi công thức xử lý và trồng 100 củ cho 3 lần lặp lạị Thời ựiểm xử lý củ cùng nhau, nhiệt ựộ xử lý và biện pháp kỹ thuật như nhaụ Từ ựó ựánh giá
sự ảnh hưởng của thời gian ủ củ tới kết quả xuân hoá và ựưa ra thời gian trồng sau xử lý lạnh hợp lý cho sự sinh trưởng phát triển và chất lượng hoạ
Thắ nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời vụ ựến kết quả xuân hoá, sinh trưởng phát triển, thời gian ra hoa và chất lượng của cây hoa lao kèn.
CT 1: Củ giống ựược trồng không qua xử lý lạnh
CT 2: Củ giống ựược xử lý lạnh ngày 10/8 và trồng ngày 15/9 CT 3: Củ giống ựược xử lý lạnh ngày 15/8 và trồng ngày 20/9