3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2Phương pháp phân lập, giám ñịnh từng loại vi khuẩn hiếu khí
trong phân
3.4.2.1 Phương pháp lấy mẫu
- Phương pháp lấy mẫu: với những ñàn lợn con mắc bệnh phân trắng phải lấy mẫu phân ngay khi lợn mới mắc bệnh, chưa ñiều trị, phân ñược lấy trực tiếp từ trực tràng. Mẫu lấy xong cho vào ống nghiệm vô trùng và bảo quản lạnh trong hộp ñá rồi chuyển ngay về phòng thí nghiệm.
- Phương pháp xử lý mẫu: mẫu lấy về nếu chưa kịp phân lập ngay sẽ
ñược bảo quản ở nhiệt ñộ 4oC.
3.4.2.2 Phương pháp ñếm số lượng và số loại vi khuẩn hiếu khí trong phân
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 35 trong phân chúng tôi sử dụng phương pháp Koch: pha loãng phân ở ñộ pha loãng nhất ñịnh rồi cấy trong môi trường thạch cứng, ñể trong tủ ấm 37oC/24h
rồi ñếm số lượng khuẩn lạc (CFU). Số lượng vi khuẩn sống có trong phân
tương ñương với số CFU ñếm ñược.
Phương pháp tiến hành: Cân 1gram phân cho vào ống nghiệm vô trùng nghiền nát với 9ml nước sinh lý ta ñược ñộ pha loãng mẫu 10-1, dùng syringe vô trùng trộn ñều nhiều lần. Sau ñó, hút 1ml hỗn dịch này sang ống nghiệm thứ 2 ñựng 9ml nước sinh lý vô trùng, trộn ñều, ta ñược ñộ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm như vậy ñến ñộ pha loãng thích hợp ñể nuôi cấy.
Sau khi pha loãng cấy 0,1ml mẫu ở ñộ pha loãng nhất ñịnh trên 1 ñĩa môi trường (ñĩa Petri ñường kính 90mm). Mỗi mẫu cấy ở 3 ñộ pha loãng liên tiếp, mỗi ñộ pha loãng cấy trên 3 ñĩa lồng.
Kết quả ñược tính theo công thức sau: X = 10.a.b
Trong ñó:
X: tổng số vi khuẩn có trong 1g phân.
a: số lượng CFU trung bình trên 1 ñĩa Petri ở cùng nồng ñộ pha loãng.
b: ñộ pha loãng mẫu.
- Xác ñịnh số loại vi khuẩn hiếu khí: Mỗi loại vi khuẩn khi mọc trên môi trường thạch thường có một ñặc tính mọc khác nhau. Phân loại CFU qua hình thái, kích thước, màu sắc, dạng khuẩn lạc (S, M, R), ñếm số lượng từng loại. Sau ñó tiến hành giám ñịnh các loại khuẩn lạc ñó bằng cách chọn các khuẩn lạc ñiển hình cho từng loại vi khuẩn cấy sang môi trường chuyên dụng.
3.4.2.3 Phương pháp giám ñịnh từng loại vi khuẩn
Việc phân lập các loại vi khuẩn ñường ruột từ phân lợn con phân trắng là việc làm rất phức tạp vì trong phân có nhiều loại vi khuẩn khác nhau và số
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 36 lượng của chúng cũng rất lớn. Chúng tôi sử dụng các loại môi trường chuyên dụng ñể phân lập và giám ñịnh từng loại vi khuẩn. Tiếp ñến tiến hành thuần khiết rồi chuyển sang môi trường thạch máu ñể giữ giống.
Cụ thể, song song với việc cấy mẫu phân trên môi trường thạch thường chúng tôi cũng cấy ñồng thời mẫu phân trên môi trường chuyên dụng là Macconkey và XLD. Sau khi nuôi cấy trong tủ ấm 37oC/24h trên môi trường Macconkey vi khuẩn E.coli mọc sẽ tạo thành khuẩn lạc có màu hồng còn trên môi trường XLD vi khuẩn Salmonella mọc sẽ tạo thành khuẩn lạc tròn có tâm màu ñen.
Từ môi trường Macconkey sẽ lấy khuẩn lạc E.coli cấy vào môi trường nước thịt ñể làm kháng sinh ñồ và cấy vào môi trường thạch máu ñể giữ giống. ðối với vi khuẩn Salmonella cũng ñược làm tương tự nhưng lấy khuẩn
lạc Salmonella từ trên môi trường XLD.
ðối với vi khuẩn Staphylococcus chúng tôi giám ñịnh khả năng gây
bệnh của chúng trên môi trường thạch Chapman. Trên môi trường này Staphylococcus có khả năng gây bệnh sẽ lên men ñường manit làm pH môi trường giảm xuồng và phenol ñỏ sẽ chuyển sang vàng. Còn vi khuẩn Streptococcus thì ñược giám ñịnh trên môi trường chuyên dụng của nó là môi trường Edwards. Sau khi giám ñịnh cả 2 vi khuẩn này ñều ñược chuyển vào nuôi cấy trên môi trường thạch máu ñể giữ giống.
3.4.3 Phương pháp xác ñịnh tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của vi
khuẩn E.coli và Salmonella spp phân lập từ phân lợn con phân trắng
Chúng tôi tiến hành làm kháng sinh ñồ theo phương pháp khuếch tán trên thạch antibiotic agar dựa theo nguyên lý của Kirby – Bauer (Bauer, 1966) với các loại giấy tẩm kháng sinh do công ty Nam Khoa thành phố Hồ Chí Minh sản xuất.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 37 lập từ các mẫu phân lợn con mắc bệnh phân trắng. Trước khi thí nghiệm vi khuẩn ñược nuôi ở 37oC/24h trong môi trường nước thịt.
Chuẩn bị môi trường, giấy tẩm kháng sinh: giấy tẩm kháng sinh ñược bảo quản ở nhiệt ñộ 2oC – 8oC. Trước khi sử dụng lấy giấy ra ngoài môi trường cho nhiệt ñộ của giấy tẩm cân bằng với nhiệt ñộ phòng.
Cách tiến hành: dùng micropipette hút 0,05ml canh khuẩn cho vào giữa ñĩa thạch. Sau ñó dàn ñều vi khuẩn lên bề mặt thạch bằng ñáy ống nghiệm vô trùng. ðể vi khuẩn ñược dàn ñều phải dùng ñáy ống nghiệm chia ñĩa thạch làm 4 phần và ria vi khuẩn trên từng phần ñó. ðợi 3 – 5 phút (không quá 15 phút) cho ráo mặt thạch. ðặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt thạch bằng các panh kẹp vô trùng. Không ñược dịch chuyển khoanh giấy khi nó ñã tiếp xúc với mặt thạch. Dùng ñầu panh ấn nhẹ khoanh giấy ñể ñảm bảo khoanh giấy tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Các khoanh giấy ñặt cạnh nhau ít nhất 24mm tương ñương 6 khoanh giấy trên một ñĩa Petri ñường kính 90mm. ðợi khoảng 15 phút, ñặt vào tủ ấm 37oC trong vòng từ 16h – 18h. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ðọc kết quả: sau khi nuôi cấy ở tủ ấm 37oC trong vòng từ 16h – 18h,
ño ñường kính vòng vô khuẩn bằng thước milimet. Nếu cạnh của vòng vô
khuẩn không rõ nét thì phải ñọc ñường kính lớn nhất, nhỏ nhất rồi cộng lại chia trung bình. ðường kính của vòng vô khuẩn ñược tính ra milimet và ñược ñánh giá ở các mức ñộ: mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I) hay kháng (R). Nếu có khuẩn lạc mọc trong vòng vô khuẩn thì phải tiến hành nuôi cấy phân lập lại.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 38
Bảng 3.1. Bảng ñánh giá ñường kính vòng vô khuẩn
ðường kính vòng vô khuẩn (mm) STT Loại kháng sinh Ký hiệu
Lượng kháng sinh (µg) R(≤) I H(≥) 1 Ciprofloxacin Cip 5 15 15 - 21 21 2 Norfloxacin Nor 10 12 12 – 17 17 3 Amikacin AN 30 9 9 – 17 17 4 Gentamicin GM 10 12 12 – 15 15 5 Kanamycin KN 30 15 15 – 18 18 6 Streptomycin SM 10 11 11 – 15 15 7 Erythromycin E 15 13 13 – 23 23 8 Doxycyclin DX 30 14 14 – 19 19 9 Tetrecyclin TE 30 17 17 – 20 20 10 Ampicillin AM 10 11 11 – 14 14 11 Sulfamethoxazol- trimethoprim SXT 23,75/1,25 10 10 – 16 16 12 Penicillin* P 6 11 11 – 22 22
(Nguồn Oxoid từ NCCLS (1990) M2A4 (Oxoid, 1982) [37]
Ghi chú: Penicillin*: ñối chứng âm ñể kiểm tra lại kết quả phân lập. H (High): mẫn cảm cao.
I (Intermediate): mẫn cảm trung bình. R (Resistant): kháng.
3.4.4 Phương pháp tiến hành ñiều trị thử nghiệm
Sau khi có kết quả làm kháng sinh ñồ trong phòng thí nghiệm chúng tôi sẽ tiến hành ñiều trị thử nghiệm trên ñàn lợn 2 tuần tuổi bị bệnh tiêu chảy phân trắng.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 39 Lợn con bị tiêu chảy ñược chia thành 4 lô thí nghiệm: lô 1 và lô 2 ñiều trị bằng 2 loại thuốc kháng sinh mà vi khuẩn E.coli và Salmonella spp mẫn cảm cao ở phòng thí nghiệm, lô 3 và 4 ñược ñiều trị bằng 2 loại kháng sinh thảo dược là cao Bồ công anh 10% và Ekodiár Plus solutio 6%.
Kết quả ñiều trị ở các lô thí nghiệm ñược ñánh giá thông qua các chỉ tiêu: tỷ lệ khỏi bệnh, tỷ lệ tái phát và thời gian ñiều trị khỏi trung bình.
3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu
Toàn bộ số liệu ñược xử lí theo phương pháp thông kê sinh học bằng phần mền Microsoft office Excel 2003.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 40 SƠ ðỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Macconkey (E.coli, Salmonella) XLD (Salmonella) Chapman (Staphylococcus) Edwards (Streptococcus)
ðếm tổng số CFU Số loại khuẩn lạc ðếm số lượng
từng loại khuẩn lạc
Thạch thường
Phân lợn con khoẻ mạnh Mẫu Phân lợn con ỉa phân trắng
Pha loãng 10x
Giám ñịnh
trên các môi trường chuyên dụng
E.coli, Salmonella thuần khiết
Nước thịt 37oC/24h
Kháng sinh ñồ
ðiều trị thử nghiệm
Thạch máu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 41 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});