Việc di nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli là một trong nhưng kỹ thuật trọng yếu và cơ bản của công nghệ DNA tái tổ hợp hay kỹ thuật di truyền học phân tử. Các loại vi khuẩn E. coli có năng lực tăng cao trong thu nhận DNA từ bên ngoài gọi là tế bào chịu di nạp hay tế bào khả biến (competent cell). Hiện tượng một vi khuẩn tiếp nhận DNA ngoại lai đó gọi là hiện tượng chịu di nạp (competency) của vi khuẩn. Kỹ thuật tạo vi khuẩn khả biến cần cho việc chế tác DNA tái tổ hợp, tái tạo dòng để xác định trình tự nucleotide, sản xuất protein đích bằng E. coli, clone hóa cDNA và tái chế plasmid vector (shuttle plasmid) (vector plasmid rescue). Hiệu suất của tế bào chịu di nạp phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó là chủng loại E. coli được sử dụng. Dưới đây mô tả 3 phương pháp tạo E. coli chịu di nạp, trong đó phương pháp dùng CaCl2 có thể được với các E. coli chủng K 12. Tuy đây là phương pháp đơn giản nhưng hiệu suất thấp (với khoảng 105 - 106 khuẩn lạc/μg pBR322 trần). Phương pháp rubidium chloride (RbCl) sử dụng được với các chủng E. coli nêu trên với hiệu suất cao hơn ít nhiều (106 - 108 khuẩn lạc/μg pBR322 trần). Phương pháp Hanahan áp dụng với nhiều chủng E. coli như JM 109, C 600, DH 1... Tuy với DH 1, chẳng hạn, có thể thu được 107 - 109 khuẩn lạc/μg pBR322 trần nhưng đây là phương pháp khá phiền phức. Chú ý rằng dù áp dụng phương pháp nào thì điều quan trọng nhất vẫn là thời điểm thu vi khuẩn từ lứa cấy có nồng độ vi khuẩn thích hợp và thực hiện chế tác ở 4 °C.
1. Phương pháp CaCl2
1) Nuôi cấy 1 ml vi khuẩn E. coli đã nuôi qua đêm vào 100 ml môi trường SOB.
2) Ủ ở 37 °C cho đến khi có mật độ tế bào 4 - 9×107 (OD550 = 0,2 - 0,4 đối với vi khuẩn rec+ và OD550 = 0,45 - 0,55 đối với vi khuẩn rec-), lắc nhẹ nhàng khi ủ.
3) Chuyển sang ống đã tiệt trùng. Để trên nước đá 10 - 15 phút. 4) Quay li tâm 1.000 ×g trong 15 phút ở 4 °C.
5) Đổ bỏ nước mặt, chỉ để lại chút nước không thể rót bỏ hết được, lật úp ống, gõ nhẹ lên mặt giấy thấm một số lần cho hết nước mặt thì tốt.
6) Cho vào ống 30 ml dung dịch CPG đã làm lạnh, trộn đảo nhẹ.
glycerol 10% (w/v) và CH3COOK (pH 7,5) 10mM, điều chỉnh pH cuối cùng đến 6,2, hấp cao áp tiệt trùng (hoặc lọc qua lọc vi khuẩn 0,2 μm).
Cũng có thể thay thế dung dịch CPG bằng dung dịch CTG hoặc CMPG có thành phần như sau:
Dung dịch CTG chứa CaCl2.2H2O 50mM, thymidine 0,05 mg/ml và glycerol 10%. Lọc qua lọc vi khuẩn hoặc hấp cao áp tiệt trùng.
Dung dịch CTG chứa CaCl2 10mM, KCl 100mM, MnCl2.2H2O 50mM, CH3COOK (pH 7,5) 10 mM và glycerol 10% (w/v). Lọc qua lọc vi khuẩn hoặc hấp cao áp tiệt trùng.
7) Để trên nước đá khoảng 30 phút.
8) Quay li tâm 1.000 ×g ở 4 °C trong 15 phút.
9) Bỏ nước mặt, chỉ để lại ít giọt dịch không thể rót bỏ hết.
10) Hòa vào 8 ml CPG đã làm lạnh. (Glycerol có trong thành phần dung dịch CPG là chất chống đóng băng, ngăn trở sự hình thành các tinh thể nước đá càng lạnh sâu càng tăng thể tích và có khả năng chọc thủng tế bào vi khuẩn).
11) Rót khoảng 0,2 - 1,0 ml vào ống có nắp (cryo vial, ống Eppendorf 1,5 hay 2,0 ml), đậy kín rồi làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng. Bảo quản trong nitơ lỏng hoặc ở −70 °C. Khi dùng cho thí nghiệm di nạp thì lấy ra để tan dần trong nước đá.
Chú ý: Phương pháp rubidium chloride không mô tả ở đây chỉ khác phương pháp calcium chloride ở việc thay thế dung dịch CPG (hoặc CTG và CMPG) nêu trên bằng dung dịch RF1 hoặc dung dịchRF2 dưới đây:
Dung dịch RF1 chứa RbCl 100mM, CH3COOK (pH 7,5) 30mM, CaCl2.2H2O 10mM, MnCl2.4H2O 50mM, glycerol 15% (w/v) và thêm acetic acid 0,2M cho đạt pH 5,8, lọc qua lọc vi khuẩn lỗ khổng 0,22 μm khử trùng.
Dung dịch RF2 chứa RbCl 10mM, CaCl2.2H2O 75mM, glycerol 15% (w/v) và MOPS (pH 6,8) 10mM; (pH cuối cùng 6,8), lọc qua lọc vi khuẩn với lỗ khổng 0,22 μm khử trùng.
2. Phương pháp Hanahan
thành huyền dịch trong 8 ml (các bước 1 ~ 9) chỉ khác là ở các bước 6) và 10) thì thay dung dịch CPG bằng dung dịch FSB.
Dung dịch FSB chứa KCl 100mM, MnCl2.4H2O 45mM, CaCl2.2H2O 10mM, hexamine cobalt chloride 3mM, CH3COOK (pH 7,5) 10mM và glycerol 10%; chỉnh pH cuối cùng đến 6,1 - 6,5, lọc qua lọc 0,2 µm khử khuẩn.
2) Để có huyền dịch vi khuẩn E. coli pha vào trong 8 ml huyền dịch thu được 280 µl DMSO (dimethylsulfoxide, nồng độ DMSO sẽ là 7%), trộn nhẹ trong 15 phút, để lạnh trên nước đá.
3) Chia 0,2 - 1,0 ml ra các ống 1,5 ml, đậy kín, làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng. Bảo quản trong nitơ lỏng hoặc ở tủ lạnh sâu −70 °C.
3. Sử dụng tế bào khả biến
1) Lấy tế bào competent ra khỏi tủ lạnh sâu hay nitơ lỏng, để nhiệt độ phòng cho dung giải rồi đặt vào nước đá (nhưng tốt hơn là cho tan từ từ bằng cách để ống trong nước đá).
2) Chia ra các ống, mỗi ống ~100 µl.
3) Thêm vào mỗi ống 1 - 10 µl DNA (ít hơn 1 µg/ống), trộn đều nhẹ nhàng trong 5 phút (vẫn giữ lạnh thì tốt hơn).
4) Để trên nước đá 10 - 30 phút.
5) Gây sốc nhiệt bằng cách để vào bể ủ 42 °C trong 50 giây (hoặc ở 37 °C trong 2 phút) (tránh lắc quấy).
6) Đưa nhanh về nước đá. Để khoảng 5 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7) Thêm vào ống 900 µl môi trường SOC (hoặc LB nhưng hiệu suất thường thấp hơn), để ở 37 °C trong 60 phút.
8) Li tâm 100 v/ph trong 5 phút, hút bỏ bớt nước mặt chỉ để lại chút ít, thêm 100 µl LB hòa thành huyền dịch.
9) Nhỏ sang bề mặt thạch đĩa LB chứa chất kháng sinh thích hợp (để tuyển lựa những tế bào đã mang plasmid hay cosmid có gen đề kháng với thuốc) và chất tuyển lựa khác (X-gal với IPTG), dùng que thủy tinh vô trùng (hoặc 5 - 7 viên bi thủy tinh vô trùng) san đều khắp mặt thạch.