GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM
Các chủng virus cường độc A/H5N1 sau 1996, qua thời gian tiến hóa, có xu hướng biến đổi nội gen nhằm tăng tính gây bệnh, và thay đổi thành phần nội gen kháng nguyên làm mất tương quan miễn dịch giữa chúng và các chủng vaccine được tạo ra. Do vậy, vấn đề này phải được hết sức chú ý trong chiến lược kiến tạo vaccine, cũng như sử dụng vaccine được tạo ra (Horimoto, Kawaoka, 2006). Trong tự nhiên, “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” là các hiện tượng xảy ra liên tục theo thời gian, còn “trộn kháng nguyên” tái tổ hợp subtype Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) thường định kỳ xảy ra giữa các loài mắc nhằm tạo nên các biến thể virus cúm mới mà hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ không có khả năng nhận dạng đáp ứng và kịp hình thành miễn dịch. H5N1 sử dụng thụ thể sialic xâm nhập tế bào (Yamada et al., 2006).
Hemagglutinin cùng với protein enzyme neuraminidase, được xác định là protein có vai trò kháng nguyên và độc lực, (Scholtissek et al., 2002; Wagner et
al., 2002 ; Keawcharoen et al., 2005) và các protein kháng nguyên có nguồn gen từ các chủng H5N1 của Việt Nam, cũng được nghiên cứu sản xuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp và sử dụng với các mục đích khác nhau trong đó có thử nghiệm làm kháng nguyên kích thích miễn dịch và chẩn đoán (Nguyễn Tiến Minh et al.,
2004; Simmons et al., 2007).
Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao, Luke, 2007). Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người (Horimoto, Kawaoka, 2001; OIE, 2005; Subbarao, Luke, 2007). Kháng thể đặc hiệu có thểđược cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng
HA(H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch. Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới (Subarao, Luke, 2007; Capua, Alexander, 2008).
Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng.
Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa (Swayne, Suarez, 2000). Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologous
vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng.
Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:
- Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1 và H7N1 (Qiao et al., 2006). Ví dụ, hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83 (H5N2), sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi.
- Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine (Peyre et al., 2008; Prel et al., 2008).
- Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirushoặc Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống virus cúm A/H5N1 (Hoelscheret al., 2006; Gao et al., 2006;
Römer-Oberdörfer et al., 2008).
- Vaccine DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen (Kodihalli et al., 1999; Keawcharoen et al., 2005).
- Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: đượcsản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen (Liu et al., 2003; Tian et al., 2005). Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). Hai chủng cúm A/H5N1 cung cấp nguồn gen H5 và N1 là A/Vietnam/1194/2004(H5N1) hoặc A/Vietnam/1203/2004(H5N1) (Nicolson et al., 2005). Trung Quốc cũng là nước sản xuất nhiều giống virus vaccine chống cúm, ví dụ, Viện Nghiên cứu Thú y Harbin (Cáp - Nhĩ - Tân) đã thành công trong việc tạo giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N2 từ chủng A/Turkey/England/N- 28/73(H5N2), loại subtype H5N2 có độc lực yếu; hay giống vaccine vô hoạt nhũ dầu đơn chủng lấy nguồn gen H5 và N1 từ chủng A/Goose/Guangdong/1996(H5N1), loại có độc lực yếu (Tian et al., 2005; Qiao et al., 2006). Các loại vaccine này đã được nhập và sử dụng tại Việt Nam từ năm 2006 cho đến nay.
Vaccine thế hệ mới chủng NIBRG-14: Chủng NIBRG-14 là giống virus vaccine nhược độc (attenuated vaccine) thế hệ mới, thuộc loại hình vaccine được xóa gen bằng công nghệ gen (gene-deletion vaccines), được lắp ráp nhân tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics –based technology) và thích ứng nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà (Marsh, Tannock, 2005).Phương pháp di truyền ngược được sử dụng để tạo ra chủng virus nhân tạo nhược độc làm vaccine, cụ thể hệ gen của chủng nhân tạo NIBRG-14 này được tái tổ hợp gen trên cơ sở sử dụng chủng gốc PR8/34 (A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)) cung cấp 6 gen khung là PA, PB1, PB2, NP, MA, NS làm nền, còn các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) được lấy từ chủng cúm cường độc gây bệnh phân lập năm 2004 tại Việt Nam (A/Vietnam/1194/2004(H5N1)) (Tian et al., 2005). Bằng thao tác kỹ thuật gen, gen H5 đã bị đột biến làm mất hẳn 4 amino acid RRRL, cùng với một số đột biến điểm ở các bộ mã ở hai đầu của vùng “độc”, làm thay đổi 3
amino acid tại vùng gây độc. Như vậy về mặt miễn dịch học, mặc dù virus được xử lý làm mất độc tính gây bệnh nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên bề mặt giống hệt như virus cúm A/H5N1 đã lấy mẫu ban đầu, do vậy, có khả năng tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên bề mặt loại virus H5N1 gây bệnh trong tự nhiên (Doherty et al., 2006; Peyre et al., 2008).
THAY LỜI KẾT LUẬN VÀ ĐỊNH HƯỚNG TƯƠNG LAI
Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi gen giúp xác định phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen (Le et al., 2005; Le Thanh Hoa et al., 2006; Dung Nguyen et al., 2008). Trên cơ sở phân tích trình tự gen kháng nguyên H5 và N1, các tác giả khẳng định nguồn gốc của virus cúm A gây bệnh trên gia cầm và người tại Việt Nam cùng nhóm với virus H5N1 phân lập tại Trung Quốc (Nguyễn Tiến Dũng et al., 2004; Lê Thanh Hòa et al., 2006;
Muramoto et al., 2006). Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông (Trung Quốc), đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông (Nguyễn Tiến Dũng et al., 2004; Lê Thanh Hòa et al., 2006; Lê Trần Bình et al., 2006).
Như vậy, virus cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông (Nguyễn Tiến Dũng et al., 2004; 2008; Li et al., 2004; Smith et al., 2006). Các chủng phân lập những năm 2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand-Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc và Hồng Kông (Li et al., 2004;
Chen et al., 2006; 2008). Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các chủng phân dòng Quảng Đông, tuy nhiên vẫn còn có khả năng bảo hộ miễn dịch (Nguyễn Mạnh Kiên et al., 2008; Lê
Thanh Hòa et al., 2008; Nguyễn Tiến Dũng et al., 2008; Dung Nguyen et al.,
2008 ; Le et al., 2008).
Nghiên cứu vấn đề gen học kháng nguyên liên quan đến vaccine và miễn dịch,đã được Viện Công nghệ sinh học, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Thú y trung ương tiến hành đó là việc thu thập gen kháng nguyên H5 và N1 từ các chủng phân lập trên gà, vịt, ngan của Việt Nam các năm 2004 - 2008, và so sánh với trình tự chuỗi gen cúm A/H5N1 của các chủng cường độc đương nhiễm và vaccine của Việt Nam và thế giới (Lê Thanh Hòa et al., 2004; Nguyễn Tiến Dũng et al., 2004; 2008; Nguyễn Thị Bích Nga, 2006; Lê Trần Bình et al., 2006; Le Thanh Hoa et al., 2006; Lê Trần Bình, 2007; Dung Nguyen et al., 2008 ; Le et al., 2008). Năm 2007, xuất hiện thêm chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến (clade 2.3.4) tại Việt Nam, chắc chắn làm phức tạp thêm vấn đề quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) qua phân tích gen giữa các chủng phân lập tại Nghệ An (Việt Nam), A/Dk/Vietnam/NA114/2007(H5N1) và A/Dk/ Vietnam/NA72/2007(H5N1), thuộc dòng Phúc Kiến) với các chủng H5N1 thuộc phân dòng Quảng Đông, bao gồm một số chủng làm vaccine đang sử dụng, chỉ đạt 94% (Lê Thanh Hòa et al., 2008 ; Nguyễn Mạnh Kiên et al., 2008). Nhận định hỗn hợp virus gây bệnh và phân hóa kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 tại Việt Nam cũng đã được xác nhận qua phân tích hàng chục chủng thu nhận từ nhiều vùng khác nhau trong cả nước (Nguyễn Tiến Dũng et al., 2008; Dung
Nguyen et al., 2008; Le et al., 2008). Điều này ảnh hưởng đến dịch tễ, chẩn đoán, phòng trừ và quan hệ lây nhiễm trong tự nhiên (Smith et al., 2006b;
Alexander, 2007), cũng như vai trò miễn dịch của các chủng cổ điển đang làm vaccine tại Việt Nam và thế giới (vaccine H5N1, chủng gốc: A-Gs-CN-
Gd1(96)(H5N1); vaccine H5N2, chủng gốc: A-Turkey-ENG-N28(73)(H5N2); vaccine TrovacAIV-H5, chủng gốc: A-Tk-IRE-1378(83)(H5N8)); vaccine H5N2, chủng gốc: A-Ck-MEX-Hidalgo-232(94)(H5N2)) và vaccine H5N1 thế hệ mới chủng NIBRG-14, sử dụng chủng gốc: A/Vietnam/1194/2004(H5N1) hiện nay đang được Việt Nam nghiên cứu sản xuất (Lê Trần Bình et al., 2006;
Lê Trần Bình, 2007; Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp, 2006).
Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân type HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Phát hiện nhanh H5N1 và các phân type khác bao gồm việc sử dụng kháng nguyên hoặc kháng thể, hoặc sinh học phân tử đã được xây dựng thành phương pháp (Chan et al., 2007; Wu et al., 2008b). Nghiên cứu vaccine và miễn dịch, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có những đóng góp nhất định về tạo chế phẩm kháng nguyên, tạo vaccine di truyền ngược hoặc vector tái tổ hợp trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam (Gao et al.,
2006; Bạch Thị Như Quỳnh, 2006; Nguyễn Thị Bích Nga, 2006; Lu et al., 2006; Ge et al., 2007).
Vềnghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ sinh học được giao đề tài độc lập cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm” và “Đánh giá chất lượng vaccine phòng bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm tại Việt Nam bằng chủng NIBRG-14” trong giai đoạn 2006 - 2008, kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp thuốc Thú y trung ương (VETVACO), Công ty Thuốc thú y trung ương II (NAVETCO), Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccine sản xuất từ chủng NIBRG-14 (Lê Trần Bình, 2007). Đây là chủng vaccine được tạo ra bằng công nghệ di truyền ngược tại Viện Tiêu chuẩn và Kiểm định sinh học Quốc gia (Vương quốc Anh), thích ứng trên phôi gà 10 ngày tuổi và vaccine tạo ra dưới dạng vô hoạt nhũ dầu. Đề tài được thực hiện trong 3 năm (2006 - 2008), kết quả là đã xây dựng được các quy trình sản xuất giống, sản xuất vaccine, kiểm nghiệm và bảo quản vaccine cúm A/H5N1 và kiểm nghiệm miễn dịch đạt
chất lượng bằng phương pháp huyết thanh học và thử thách cường độc (Nguyễn Thị Lan Phương, Lê Văn Hiệp, 2006; Lê Trần Bình, 2007). Ngoài ra, một số đề tài nhà nước khác nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền gen kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc LaSoTa virus, chuyển gen vào thực vật cũng được tiến hành (trao đổi riêng: Trương Nam Hải; Trương Văn Dung; Lê Trần Bình; Lê Thanh Hòa; Nguyễn Tiến Dũng và nhiều người khác). Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật/công nghệ cao (di truyền ngược, tái tổ hợp vector) sử dụng nguồn gen H5N1 của Việt Nam, công nghệ tái tổ hợp sản xuất chế phẩm kháng nguyên H5 trong thực vật và tế bào, cũng đang được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Thú y, Viện Di truyền nông nghiêp và một số cơ sở nghiên cứu khác (Lê Trần Bình, 2007; Lê Thanh Hòa, 2006a; Nguyễn Tiến Dũng et al., 2008). Song song với những nội dung nghiên cứu về cúm gia cầm ở gia cầm, các cơ sở y tế gồm bệnh viện, viện nghiên cứu (Bệnh viện Nhi trung ương, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vaccine Nha Trang) đều có những triển khai các lĩnh vực nghiên cứu liên quan đến cúm A/H5N1 trên người (Le et al., 2005; 2008; Nguyễn Thị Kim Tiến, 2005; Dinh et al., 2006; Chan et al., 2007; Hatta et al., 2007)
Những kết quả nghiên cứu về cúm A/H5N1 ở gia cầm và người trên nền virus cúm A/H5N1 của Việt Nam đã và đang làm sáng tỏ thêm về mối quan hệ tiến triển bệnh học lây nhiễm, dịch tễ học phân tử, phát triển tiến hóa và genotype và kháng nguyên - miễn dịch - vaccine của cúm gia cầm tại Việt Nam.
Lời cảm ơn:Chúng tôi cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ cấp kinh phí cho
đề tài độc lập cấp nhà nước về nghiên cứu vaccine cúm A/H5N1 do GS. TS. Lê
Trần Bình chủ nhiệm và đề tài Nghị định thư Việt Nam - Thái Lan về sinh học
phân tử cúm A/H5N1 do PGS. TS. Lê Thanh Hòa làm chủ nhiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Alexander DJ (2007) An overview of the epidemiology of avian influenza.
Vaccine 25(30): 5637-44. Review.
resistance to oseltamivir. Antivir Ther 12(4B): 603-616. Review. 3.Arinaminpathy N, McLean AR (2008) Antiviral treatment for the control of pandemic influenza: some logistical constraints. J R Soc Interface 5(22): 545- 553.
4.Bạch Thi Như Quỳnh (2006) Nghiên cứu tạo giống từ chủng gốc NIBRG - 14
để phục vụ sản xuất vaccine cúm H5N1. Luận văn Thạc sĩ sinh học, Viện Sinh
thái và tài nguyên sinh vật.
5.Baigent SJ, McCauley JW (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk- length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza
viruses in tissue culture. Virus Res 79(1-2): 177-185.
6.Basler CF (2007) Influenza viruses: basic biology and potential drug targets.
Infect Disord Drug Targets 7(4): 282-93. Review.
7.Bauer TT, Ewig S, Rodloff AC, Müller EE (2006) Acute respiratory distress syndrome and pneumonia: a comprehensive review of clinical data. Clin Infect
Dis 43(6): 748-756. Review.
8.Bender C, Hall H, Huang J, Klimov A, Cox N, Hay A, Gregory V, Cameron K, Lim W and Subbarao K (1999) Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 - 1998. Virology 254: