Có nhiều phƣơng pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên. Việc lựa chọn phƣơng pháp thích hợp dựa trên các thông số nhƣ loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005). Theo Boenisch và ctv (2002), có 5 phƣơng pháp nhuộm có thể đƣợc sử dung:
A. Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất. Quá trình thực hiện nhƣ sau: Một kháng thể sơ cấp đƣợc đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng. Phƣơng pháp này tiết kiệm đƣợc thời gian nhƣng tín hiệu thu đƣợc rất ít, không dủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay.
B. Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể sơ cấp (thƣờng là đơn dòng) kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp (thƣờng là đa dòng) đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu. Phƣơng pháp này linh hoạt và nhạy hơn phƣơng pháp nhuộm trực tiếp..
C. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Từ phƣơng pháp B, bổ sung thêm một kháng thể thứ cấp 2 kháng lại kháng thể thứ cấp 1. Cả hai kháng thể thứ cấp này phải đƣợc đánh dấu với cùng enzyme. Việc bổ sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu. Phƣơng pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope.
D.Phương pháp phức hợp miễn dịch enzyme tan: Tuỳ theo phúc hợp miễn dịch enzyme, ta có các phƣơng pháp khác nhau.Ví dụ: Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng peroxidase. Trƣớc tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp với một lƣợng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một loài. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài đó.
E.Phương pháp (strept)avidin-biotin: Phƣơng pháp nhuộm này dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà) với biotin với độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao. Thành phần cơ bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin-biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thƣờng đƣợc sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU