3.3.2.1. Tách chiết DNA
DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất
lượng cao, tốn nhiều thời gian nhưng rẻ tiền hơn so với nhiều phương pháp khác (Henry T Nguyen, 1998). Quy trình gồm những bước sau:
- Bước 1: Chọn và thu mẫu lá dứa (50 mẫu), chọn lá khỏe, non (2 cm) đặt vào ống tube và ghi nhãn cẩn thận. Ống tube chứa mẫu được giữ trong thùng đá lạnh.
- Bước 2: Lá sẽ được rửa sạch, cắt nhỏ và đặt vào đĩa (spot test plate).
- Bước 3:Thêm vào đĩa 660 µl dung dịch đệm ly trích DNA (DNA extraction buffer) (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 500 mM NaCl ). Nghiền các mô lá với chài (dụng cụ này phải được khử trùng bằng cồn và lau sạch trước khi sử dụng).
- Bước 4: Tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị phá vỡ và phóng thích diệp lục. Dung dịch nghiền xong phải đặt vào đá khoảng 30 phút.
- Bước 5: Thêm vào 660 l dung dịch tách chiết, trộn đều và chuyển 660 l dịch nghiền vào một tube sạch với thể tích là 1,5 – 2 ml đã được ghi nhãn cẩn thận.
- Bước 6: Thêm 40 l SDS 20 % trộn đều và khéo léo, sau đó ủ trong water bath và lắc đều 10 phút ở nhiệt độ 650
C.
- Bước 7: Thêm vào dung dịch 100 l NaCl 5M và trộn thật kỹ. Thêm tiếp 100 l CTAB. Ủ dung dịch 10 phút ở nhiệt dộ 650C.
- Bước 8: Thêm 900 l Chlorofom: iso amylalcohol (24:1) trộn đều và đem ly tâm trong 3 phút với tốc độ 13.000 vòng / phút.
- Bước 9: Chuyển dịch nổi vào một tube mới 1,5 – 2 ml và thêm vào 600 l isopropanol trộn đều, tiếp tục ly tâm trong 5 phút với tốc độ 12000 vòng / phút. Sau khi ly tâm, đổ bỏ phần dung dịch phía trên.
- Bước 10: Rửa phần kết tủa còn lại với cồn 70 % và phơi khô. - Bước11: Hòa tan DNA với 50 l TE . Giữ ở nhiệt độ -200
C.
